2.5.1 Природа градиентов
Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным рН. В некоторых случаях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D 2 0. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы.
Выбор градиента диктуется конкретными задачами фракционирования. Так, например, фикол, выпускаемый фирмой Pharmacia Fine Chemicals, может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана»
2.5.2 Методика создания ступенчатого градиента плотности
Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку.
2.5.3 Методика создания плавного градиента плотности
В большинстве случаев для создания плавного градиента плотности пользуются специальным устройством. Оно состоит из двух цилиндрических сосудов строго определенного одинакового диаметра, сообщающихся друг с другом в нижней части с помощью стеклянной трубки с контрольным клапаном, что позволяет регулировать пропорции, в которых смешивается содержимое обоих сосудов. Один из них снабжен мешалкой и имеет выходное отверстие, через которое раствор стекает в центрифужные пробирки. Более плотный раствор помещают в смеситель; второй цилиндр заполняют раствором меньшей плотности. Высота столбика растворов в обоих цилиндрах устанавливается таким образом, чтобы гидростатическое давление в них было одинаковым. Более плотный раствор постепенно выпускается из смесителя в центрифужные пробирки и одновременно замещается равным объемом раствора меньшей плотности, поступающего в смеситель из второго цилиндра через контрольный клапан. Гомогенность раствора в смесителе обеспечивается за счет постоянного перемешивания раствора с помощью мешалки. По мере сливания раствора в центрифужные пробирки плотность его уменьшается и в пробирках создается линейный градиент плотности. Нелинейные градиенты можно создавать при помощи системы, состоящей из двух цилиндров неодинакового диаметра.
Для формирования градиентов плотности различной крутизны пользуются системой из двух механически управляемых шприцов, которые заполняют растворами неодинаковой плотности. Различные градиенты можно создавать, изменяя относительную скорость движения поршней.
2.5.4 Извлечение градиентов из центрифужных пробирок
После завершения центрифугирования и разделения частиц необходимо извлечь образовавшиеся зоны. Это делают несколькими способами, чаще всего методом вытеснения. Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60-70%-ный раствор сахарозы. Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций. Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллюлозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой. При подходящей конструкции режущего устройства потеря раствора будет минимальной. Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.
2.5.5 Препаративные центрифуги и их применение
Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги. Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об мин -1 и ОЦУ до 6000 g . Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Одной из особенностей этого вида центрифуг является их большая емкость - от 4 до 6 дм 3 , что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10,50 и 100 см 3 , но и сосудами емкостью до 1,25 дм 3 . Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.
Скоростные центрифуги дают предельную скорость 25 000 об-мин -1 и ОЦУ до 89000g. Камера ротора снабжена системой охлаждения, предотвращающей нагревание, которое возникает вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм 3 и снабжены сменными роторами, как угловыми, так и с подвесными стаканами.
Препаративные ультрацентрифуги дают предельную скорость до 75000 об-мин -1 и максимальное центробежное ускорение 510 000 g . Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев ротора вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых или титановых сплавов. В основном применяют роторы из алюминиевых сплавов, однако в тех случаях, когда необходимы особенно высокие скорости, пользуются роторами из титана. Для уменьшения вибрации, возникающей в результате нарушения равновесия ротора из-за неравномерного наполнения центрифужных пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Центрифужные пробирки и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1 г. Аналогичные требования следует соблюдать и при загрузке роторов центрифуг общего назначения.
2.6 Конструкция роторов
2.6.1 Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами
Роторы препаративных центрифуг обычно бывают двух типов - угловые и с подвесными стаканами. Угловыми они называются потому, что помещаемые в них центрифужные пробирки все время находятся под определенным углом к оси вращения. В роторах с подвесными стаканами пробирки устанавливаются вертикально, а при вращении под действием возникающей центробежной силы переходят в горизонтальное положение; угол наклона к оси вращения составляет 90°.
В угловых роторах расстояние, проходимое частицами до соответствующей стенки пробирки, весьма невелико, и поэтому седиментация происходит сравнительно быстро. После столкновения со стенками пробирки частицы соскальзывают вниз и образуют на дне осадок. При центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение частиц с близкими седиментационными свойствами. Тем не менее роторы подобной конструкции с успехом применяются для разделения частиц, скорости седиментации которых различаются довольно сильно.
В роторах с подвесными стаканами также наблюдаются конвекционные явления, однако выражены они не так сильно. Конвекция является результатом того, что под действием центробежного ускорения частицы оседают в направлении, не строго перпендикулярном оси вращения, и поэтому, как и в угловых роторах, ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно.
Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы в роторах с подвесными стаканами и регулируя скорость вращения ротора; перечисленных выше, недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности.
2.6.2 Роторы непрерывного действия
Роторы непрерывного действия предназначены для скоростного фракционирования относительно небольших количеств твердого материала из суспензий больших объемов, например для выделения клеток из питательных сред. В ходе центрифугирования суспензия частиц добавляется в ротор непрерывно; пропускная способность ротора зависит от природы осаждаемого препарата и варьируете пределах от 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 мин. Особенность ротора состоит в том, что он представляет собой изолированную камеру специальной конструкции; содержимое ее не сообщается с внешней средой, а поэтому не загрязняется и не распыляется.
2.6.3 Зональные роторы, или роторы Андерсона
Зональные роторы делают из алюминиевых или титановых сплавов, которые способны выдерживать весьма значительные центробежные ускорения. Обычно в них имеется цилиндрическая полость, закрывающаяся съемной крышкой. Внутри полости, на оси вращения расположена осевая трубка, на которую надевается насадка с лопастями, разделяющими полость ротора на четыре сектора. Лопасти или перегородки имеют радиальные каналы, по которым из осевой трубки к периферии ротора нагнетается градиент. Благодаря такой конструкции лопастей конвекция сведена до минимума.
Заполнение ротора производится при его вращении со скоростью около 3000 об/мин -1 . В ротор нагнетают заранее созданный градиент, начиная со слоя наименьшей плотности, который равномерно распределяется по периферии ротора и удерживается у внешней его стенки перпендикулярно оси вращения благодаря центробежной силе. При последующем добавлении слоев градиента большей плотности происходит непрерывное смещение к центру менее плотных слоев. После того как в ротор будет нагнетен весь градиент, его заполняют до полного объема раствором, называемым «подушкой», плотность которого совпадает или несколько превышает наибольшую плотность преформированного градиента.
Затем через осевую трубку, наслаивают исследуемый образец, который вытесняют из трубки в объем ротора с помощью раствора меньшей плотности, при этом с периферии удаляется такой же объем «подушки». После всех этих процедур скорость вращения ротора доводят до рабочей и в течение необходимого промежутка времени проводят либо зонально-скоростное, либо зонально-изопикническое фракционирование. Извлечение фракций проводят при скорости вращения ротора 3000 об - мин -1 . Содержимое ротора вытесняют путем добавления с периферии «подушки», в первую очередь вытесняются менее плотные слои. Благодаря особой конструкции осевого канала ротора Андерсона смешивания зон при их вытеснении не происходит. Выходящий градиент пропускают через регистрирующее устройство, например ячейку спектрофотометра, с помощью которого по поглощению при 280 нм можно определить содержание белка, или через специальный детектор радиоактивности, после чего собирают фракции.
Емкость зональных роторов, используемых при средних скоростях, варьирует от 650 до 1600 см 3 , что позволяет получать довольно большое количество материала. Зональные роторы применяются для удаления белковых примесей из различных препаратов и для выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков.
2.6.4 Анализ субклеточных фракций
Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства.
Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл: например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы - маркерами лизосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р -глюкуронидаза, НАДФ" Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органеллами или он ингибируется или инактивируется; поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров.
|
Фракция |
Объем, см" |
Общее разведение |
Экснюк-ция, 660 нм |
Единицы активности фермента |
Выход активности во фракции, % |
2.7 Фракционирование методом дифференциального центрифугирования
2.7.1 Оформление результатов
Результаты, полученные при фракционировании тканей, удобнее всего оформлять в виде графиков. Так, при исследовании распределения ферментов в тканях данные лучше всего представлять в виде гистограмм, дающих возможность визуально оценить результаты проведенных экспериментов.
Ферментативную активности содержание белка в пробе определяют как в исходном гомогенате, так и в каждой выделенной субклеточной фракции в отдельности. Суммарная ферментативная активность и содержание белка во фракциях не должны сильно отличаться от соответствующих значений в исходном гомогенате.
Затем проводят расчет ферментативной активности и содержания белка в каждой фракции в % от общего выхода, на основании чего составляют гистограмму. По оси абсцисс последовательно откладывают относительное количество_ белка в каждой фракции в порядке их выделения, а по оси ординат - относительную удельную активность каждой фракции. Таким образом, по площади столбиков определяют ферментативную активность каждой фракции.
2.7.2 Аналитическое ультрацентрифугирование
В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70 000 об-мин -1 , создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g . Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Вращается ротор в вакуумной камере, снабженной холодильным устройством, и имеет две ячейки, аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально, параллельно оси вращения. Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются также два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния в аналитической ячейке. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см 3 , имеет секториальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая почти идеальные условия седиментации. На торцах аналитической ячейки имеются окошки с кварцевыми стеклами. Аналитические ультрацентрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в ультрафиолете, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления - с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея. Два последних метода основаны на том, что при прохождении света через прозрачный раствор, состоящий из зон с различной плотностью, на границе зон происходит преломление света. При седиментации между зонами с тяжелыми и легкими частицами образуется граница, которая действует как преломляющая линза; при этом на фотопластинке, использующейся в качестве детектора, появляется пик. В ходе седиментации происходит перемещение границы, а следовательно, и пика, по скорости передвижения которого можно судить о скорости седиментации материала. Интерферометрические системы отличаются большей чувствительностью, чем шлирен-системы. Аналитические ячейки бывают односекторные, которые применяются наиболее часто, и двухсекторные, которые используются для сравнительного изучения растворителя и растворенного вещества.
В биологии аналитическое ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярных весов макромолекул, проверки чистоты получаемых образцов, а также для исследования конформационных изменений в макромолекулах.
2.8 Применение аналитического ультрацентрифугирования
2.8.1 Определение молекулярных весов
Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования: определение скорости седиментации, метод седиментациоиного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию.
Определение молекулярного веса по скорости седиментации - это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.
Скорость седиментации определяется следующим соотношением:
где х - расстояние от оси вращения в см,
t - время в с,
w - угловая скорость в рад-с -1 ,
s - коэффициент седиментации "молекулы.
Коэффициент седиментации - это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сеедберга ; 1 единица Сведберга равна 10 _13 с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35S, субъединицы рибосом бактерий - от 30 до 50S, а субъединицы рибосом эукариотов - от 40 до 60S.
где М - молекулярный вес молекулы, R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, s - коэффициент седиментации молекулы, D - коэффициент диффузии молекулы, v - парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р - плотность растворителя.
Метод седиментациоиного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 000-8 000 об-мин -1 , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных - с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества "согласно формуле
где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, ю - угловая скорость, р - плотность растворителя, v - парциальный удельный объем, с х и с 2 - концентрация растворенного вещества на расстояниях г г и г 2 от оси вращения.
Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время - от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.
Метод приближения к седиментационному равновесию былразработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для "установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам:
где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, v - парциальный удельный объем, р - плотность растворителя, dcldr - градиент концентрации макромолекулы, г м и г д - расстояние до мениска и дна пробирки соответственно, с м и с д - концентрация макромолекул у мениска и у дна пробирки соответственно, М м и M R -величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно.
2.8.2 Оценка чистоты препаратов
Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации: гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча; они же обусловливают асимметрию основного пика.
2.8.3 Исследование конформационных изменений в макромолекулах
Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования - исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Чем компактнее молекула, тем меньше ее коэффициент трения в растворе и наоборот: чем менее она компактна, тем больше коэффициент трения и, следовательно, тем медленнее будет она седиментировать. Таким образом, различия в скорости седиментации образца до и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конформационные изменения, происходящие в макромолекулах.
У аллостерических белков, таких, например, как аспартат-транскарбамоилаза, конформационные изменения возникают в результате связывания их с субстратом и малыми лигандами. Диссоциацию белка на субъединицы можно вызывать, обработав его такими веществами, как мочевина или парахлормеркурибензоат. Все эти изменения легко можно проследить при помощи аналитического ультрацентрифугирования.
Формования трубчатых изделий методом центрифугирования . Под центрифугированием в промышленность строительных материалов... которых осуществляется такое воздействие, называются центрифугированием . В промышленности РБ используются горизонтальные центрифуги...
Осаждение частиц
Лабораторная работа >> ХимияКлеток, уже освобожденного низкоскоростным центрифугированием от ядра, митохондрий и... ультрацентрифугирование Особенности этого типа центрифугирования отражены в самом его... для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, ...
Использование центрифуги
Курсовая работа >> Промышленность, производствоВ центрифугах периодического действия различные операции центрифугирования – загрузка, разделение, выгрузка – происходят... различают препаративное и аналитическое центрифугирование . При препаративном центрифугировании исходный биологический материал берут...
Фильтрование - процесс отделения взвешенных твердых частиц в жидкостях или газах. Жидкость или газ с находящимися в них частицами твердого вещества пропускают через пористый материал (фильтр), размеры пор которого столь малы, что частицы твердого тела не проходят сквозь фильтр. Размеры пор определяют способность фильтра задерживать твердые частицы различной крупности, а также его производительность, т. е. количество жидкости, которое может быть отделено в единицу времени.
На процесс фильтрования влияют вязкость жидкости и разность давлений по обе стороны фильтра. Чем выше вязкость жидкости, тем труднее ее фильтровать. Так как вязкость жидкости понижается с повышением температуры, то горячие жидкости легче фильтровать, чем холодные. Фильтрование вязких жидкостей часто можно облегчить, разбавляя их растворителем, который по окончании фильтрования можно легко отогнать. Чем больше разность давлений, тем выше скорость фильтрования. Поэтому фильтрование часто проводят при уменьшенном или избыточном давлении. При фильтровании под давлением студнеобразных осадков последние плотно прилегают к фильтру, поры которого легко забиваются, и фильтрование прекращается.
Если размер частиц твердой фазы меньше размера пор фильтра, отфильтровать взвесь не удается. Так, обычные бумажные фильтры не задерживают мелкодисперсные частицы многих коллоидных растворов. В таких случаях перед фильтрованием коллоидный раствор нагревают или к нему добавляют электролит, что приводит к коагуляции (укрупнению частиц и образованию осадка).
Когда цель фильтрования - получение прозрачного фильтрата, а не чистого осадка, для лучшего отделения мелкодисперсных частиц от жидкости к последней прибавляют небольшое количество порошкообразного активного угля, взбалтывают и фильтруют.
Фильтрование смесей, содержащих вещества, которые забивают поры фильтра и образуют на нем вязкие слои, часто облегчается добавлением мелкого кварцевого песка, инфузорной земли, асбестового волокна, целлюлозной (бумажной) массы.
Фильтрование можно проводить различными способами, в зависимости от характера фильтруемых жидкостей и свойств твердой фазы (осадка), которую нужно отделить от жидкости или газа.
Если твердая фаза смеси легко осаждается, то большую часть ее можно удалить перед самим фильтрованием путем декантации. Декантация - наиболее простой метод разделения твердой и жидкой фаз - основана на том, что при отсутствии перемешивания твердое вещество оседает на дно сосуда и прозрачная жидкость может быть отделена сливанием с отстоявшегося осадка. Иногда декантацию можно использовать и для разделения двух твердых веществ с различной плотностью. Для промывания труднорастворимых твердых веществ часто используют декантацию с помощью сифона (рис. 118). Промывание декантацией значительно более эффективно, чем промывание осадка на фильтре, где жидкость обычно не проникает равномерно между частицами твердого вещества.
Фильтрование под действием собственного веса жидкости
Этот способ фильтрования обычно используется в тех случаях, когда отфильтрованная твердая фаза не нужна (удаление механических загрязнений из растворов), или когда жидкая фаза может быть полностью удалена многократной обработкой осадка соответствующим растворителем.
Обычное фильтрование применяют, когда приходится фильтровать горячие концентрированные растворы или растворы кристаллических веществ в летучих растворителях. При фильтровании подобных растворов в вакууме растворитель испаряется под фильтром, который резко охлаждается и забивается выделяющимися кристаллами.
В качестве фильтрующего материала, в основном, используют различные сорта фильтровальной бумаги, готовые бумажные обезжиренные и беззольные фильтры.
Фильтровальная бумага для непосредственного использования выпускается двух марок: ФНБ - быстрой фильтрации с размером пор 3,5-10 мкм и ФНС - средней скорости фильтрации с размером пор 1-2,5 мкм. Зольность бумаги этих марок - до 0,2%.
Для изготовления беззольных и обезжиренных бумажных фильтров выпускается фильтровальная бумага трех марок: ФОБ - быстрой фильтрации; ФОС - средней фильтрации; ФОМ - медленной фильтрации.
Готовые бумажные фильтры круглой формы обезжиренные (с желтой лентой) и беззольные выпускаются различного диаметра в пачках по 100 шт. Выбор размера фильтра зависит от массы отделяемого твердого вещества, а не от объема фильтруемой жидкости.
Беззольные фильтры для лабораторных работ различаются по разделительной (задерживающей) способности. Это различие определяется по цвету бумажной ленты, которой оклеивают упаковку.
Приняты следующие обозначения: белая лента - быстро фильтрующие, красная - средне фильтрующие, синяя - медленно фильтрующие, предназначенные для фильтрования мелкозернистых осадков (типа BaSO4).
Выбор марки фильтра в каждом отдельном случае зависит от свойств отделяемого твердого вещества. Очень плотными фильтрами следует пользоваться только тогда, когда это действительно необходимо.
Фильтровальную бумагу и готовые фильтры нельзя использовать для фильтрования концентрированных растворов сильных кислот или щелочей, так как при этом снижается механическая прочность фильтров.
Бумажные фильтры бывают простые и складчатые (плоеные). Для изготовления простого гладкого фильтра круглый кусок фильтровальной бумаги определенного размера складывают в четыре раза и обрезают ножницами так, чтобы получился сектор круга. Зависимость диаметра фильтра от диаметра стеклянной воронки для фильтрования представлена ниже:
Гладкий фильтр должен плотно прилегать к стенкам воронки, в особенности в верхней части. Для этого рекомендуется при складывании фильтра сгибать полукруг не по средней линии, а по близкой к ней параллельной линии.
Сложенный фильтр помещают в воронку (заполнять его осадком можно не более чем на 1/3 или 1/2), смачивают его дистиллированной водой и заполняют водой носик (трубку) воронки. Для этого фильтр приподнимают и быстро опускают. Края фильтра должны быть на 5-10 мм ниже края воронки. Мокрый фильтр осторожно прижимают к воронке. Фильтрование начинают немедленно, чтобы носик воронки оставался заполненным жидкостью. Нельзя наполнять воронку раствором более чем на 3/4 объема. Кончик носика должен касаться внутренней стенки стакана с фильтратом, чтобы предотвратить разбрызгивание.
Простые гладкие фильтры обычно используются в аналитических лабораториях для фильтрования разбавленных растворов.
Фильтрование значительно ускоряется при пользовании складчатыми фильтрами. Эти фильтры легко изготовить (рис. 119). Складки фильтра не должны подходить вплотную к его центру, иначе бумага в центре фильтра может прорваться. Готовый фильтр, вставляют в воронку так, чтобы он прилегал к ее стенкам. Если воронка имеет угол больше или меньше 60°, фильтр подгоняют к ней, изменяя положение второго сгиба. Необходимо, чтобы фильтр имел достаточно острый конец, фильтровальная бумага не была испорчена многократным сгибанием.
Прежде чем поместить приготовленный фильтр в воронку, его разворачивают и перегибают так, чтобы внешняя сторона фильтровальной бумаги оказалась на внутренней стороне фильтра. Правильно уложенный в воронку фильтр смачивают фильтруемой жидкостью или дистиллированной водой.
При фильтровании горячих растворов и употреблении воронок большого диаметра верхушка фильтра может прорваться. Для устранения этой опасности в большую воронку вставляют маленькую или специальную дырчатую фарфоровую вставку, а лучше всего фильтровать через два сложенных вместе складчатых фильтра.
Оборудование для фильтрования при атмосферном давлении и комнатной температуре несложно и состоит из воронки, фильтра, приемника и штатива. Для фильтрования горячих насыщенных растворов твердых веществ применяют широкие укороченные воронки, а для быстрого фильтрования больших объемов жидкостей - рифленые воронки, неровные стенки которых в сочетании с гладкими фильтрами увеличивают эффективную фильтрующую поверхность. Воронку укрепляют в кольце, присоединенном к лабораторному штативу, или вставляют ее непосредственно в горло колбы - приемника фильтрата. В последнем случае необходимо помещать под воронку полоску фильтровальной бумаги, чтобы воздух, вытесняемый фильтратом, мог выходить из колбы.
Часто фильтрование бывает затруднено, если между бумажным фильтром и стенкой воронки образуется прослойка воздуха (воздушный карман). Чтобы этого избежать, внутри воронки создают небольшое избыточное давление: воронку накрывают смоченным по краям куском фильтровальной бумаги и перевернутой воронкой такого же диаметра. Через трубку верхней воронки при помощи резиновой груши нагнетают воздух и тем самым устраняют воздушный карман.
Для ускорения фильтрования удлиняют трубку воронки: к носику резиновой трубкой подсоединяют стеклянную трубку того же (или немного меньшего) внутреннего диаметра. Через некоторое время вся трубка заполняется столбом фильтрата, создающим разрежение.
Сильнощелочные растворы и растворы фтористоводородной кислоты рекомендуется фильтровать через воронку из пористого полиэтилена. Для изготовления подобной воронки (рис. 120) используют две стеклянные воронки, из которых внешнюю закрывают в месте сужения пробкой, а внутреннюю в том же месте заплавляют. Смесь полиэтиленового порошка и мелкоизмельченного хлорида натрия в массовом соотношении 1:4 помещают между стенками воронок и выдерживают в сушильном шкафу при 130-150 °С. Время от времени внутреннюю воронку поворачивают при надавливании, чтобы равномерно нанести полужидкую массу на внутреннюю поверхность внешней воронки. После охлаждения внутреннюю воронку вынимают, извлекают пробку из трубки внешней воронки и спекшуюся массу промывают теплой водой для удаления хлорида натрия.
Скорость фильтрования прямо пропорциональна гидростатическому давлению фильтруемой жидкости, поэтому в процессе фильтрования больших объемов жидкостей выгодно поддерживать постоянный уровень жидкости на фильтре. На рис. 121 изображены простые самодельные устройства для автоматического доливания жидкости на фильтр. Сосуд с жидкостью закрывают чистой резиновой пробкой, снабженной трубкой для поступления жидкости и трубкой для поступления воздуха. Уровень нижнего конца трубки для поступления воздуха определяет уровень жидкости на фильтре. Если уровень понижается, то воздух проникает внутрь сосуда и выдавливает жидкость на фильтр. В результате уровень жидкости на фильтре повышается, а доступ воздуху внутрь сосуда закрывается.
Фильтрование при нагревании или охлаждении
Фильтрование при нагревании проводят, когда необходимо очистить горячие концентрированные растворы от примесей, профильтровать вязкие растворы, а также растворы, содержащие легко кристаллизующиеся при обычной температуре вещества.
В первую очередь нужно тщательно выбрать сорт фильтровальной бумаги, размер фильтра и воронки, с тем чтобы ускорить процесс. Прежде чем налить горячий раствор на фильтр, воронку с вложенным фильтром подогревают, пропуская через фильтр некоторое количество горячего чистого растворителя или пары растворителя, если его нагреть в бане до кипения. В последнем случае воронку накрывают часовым стеклом. Перед фильтрованием растворитель из приемника выливают, чтобы он не разбавлял фильтрат. На фильтре следует поддерживать высокий уровень жидкости для ускорения фильтрования.
Воронку с фильтром можно обогревать также металлической воронкой для горячего фильтрования (рис. 122, а) или воронкой, между двойными стенками которой пропускают горячую воду, водяной пар или горячий воздух (рис. 122, б). Подогрев можно также осуществить погружением электронагревателя в фильтруемый раствор, если в последнем не содержатся вещества, реагирующие с металлом.
Для равномерного нагревания стеклянной лабораторной посуды применяют также вязаные чехлы (колпаки) с электрообогревом. Они обычно изготовляются из тонкой стеклянной нити и содержат гибкий нагревательный элемент в виде тонкой проволоки или спирали.
Фильтрование при охлаждении может быть проведено в воронке, охлаждаемой льдом, или в воронке, между двойными стенками которой пропускают охлажденный солевой раствор.
Фильтрование при пониженном давлении
Фильтрование при пониженном давлении позволяет достигнуть более полного отделения твердого вещества от жидкости и увеличить скорость процесса.
Аппаратура для фильтрования под вакуумом состоит из устройства для фильтрования, приемника, водоструйного насоса и предохранительной склянки.
При фильтровании больших количеств веществ чаще всего используют дырчатые фарфоровые или щелевидные стеклянные цилиндрические воронки Бюхнера, вставленные в конические колбы для фильтрования под вакуумом с тубусом; последние присоединяются к водоструйному насосу через предохранительную склянку. Необходимо, чтобы размер воронки соответствовал количеству отфильтрованного твердого вещества, которое должно полностью покрывать поверхность фильтра. Однако слишком толстый слой осадка затрудняет отсасывание и последующее его промывание.
Фильтр для воронок Бюхнера представляет собой круглый лист фильтровальной бумаги, помещаемый на дырчатую перегородку воронки. Диаметр фильтра должен быть немного меньше, чем диаметр перегородки. На большие воронки Бюхнера обычно кладут друг на друга два фильтра. Чтобы подогнанный бумажный фильтр достаточно плотно прилегал к дырчатой перегородке воронки, его предварительно смачивают на воронке растворителем и равномерно прижимают к ней. Затем, после удаления растворителя, наливают в воронку фильтруемую смесь и отсасывают.
В случае водных растворов небольшие количества воды, используемой для смачивания фильтра, не имеют значения. В тех же случаях, когда присутствие воды недопустимо, влажный фильтр, добившись плотного его прилегания, промывают этиловым спиртом или ацетоном, а затем растворителем, присутствие которого в фильтрате допустимо. Фильтровальная бумага, смоченная органическим растворителем, не пристает к воронке так хорошо, как при смачивании водой.
Воронки Бюхнера укрепляются в конических колбах при помощи резиновых пробок или толстых плоских кусков резины, закрывающих горло колбы сверху; последние удобны тем, что не могут быть втянуты в колбу при отсасывании во время фильтрования.
Для полного отделения маточного раствора осадок на фильтре отжимают плоской поверхностью стеклянной пробки, или толстостенным цилиндром с плоским дном до тех пор, пока жидкость не перестанет капать. При этом необходимо следить, чтобы на поверхности толстого слоя осадка не образовывались трещины, так как это ведет к неполному отсасыванию маточного раствора и загрязнению осадка. Чтобы удалить остатки маточного раствора, осадок промывают на фильтре небольшими порциями растворителя при атмосферном давлении. Когда осадок на фильтре пропитается растворителем, вновь подключают вакуум для отсасывания.
При фильтровании с отсасыванием в качестве фильтрующего материала кроме обычных бумажных фильтров применяют фильтры из синтетического волокна. Так, фильтры из поливинилхлоридного или полиэфирного волокна устойчивы к действию кислот и щелочей, но разрушаются органическими растворителями.
Для отделения трудно фильтрующихся липких осадков нередко применяют асбестовую массу, которую можно уплотнить на воронке для отсасывания или тигле Гуча. Асбестовую массу готовят следующим образом: в фарфоровой ступке асбест растирают с конц. НСl, переносят массу в стакан и кипятят 20-30 мин в вытяжном шкафу. Затем разбавляют массу 20-30-кратным объемом дистиллированной воды, фильтруют на воронке Бюхнера и промывают водой до исчезновения кислой реакции в фильтрате. Затем массу высушивают при 100-120 °С и прокаливают в муфеле. Прокаленный асбест взбалтывают с водой до получения однородной массы, переносят на фильтрующую пластину воронки или тигля Гуча, отсасывают и уплотняют.
Чрезвычайно удобны для фильтрования воронки, тигли и газовые фильтры со впаянной пластинкой из спекшегося стеклянного порошка. Стеклянные фильтры служат для отделения твердых веществ от жидкостей при фильтровании и экстракции, для удаления частиц тумана из газов, для барботирования (распределения) газов в жидкостях. Стеклянные фильтры, однако, неудобны в тех случаях, когда требуется количественное выделение осадка, так как полностью снять осадок с фильтра трудно. Они не пригодны для фильтрования очень концентрированных горячих растворов щелочей и карбонатов щелочных металлов.
Пористость пластинок стеклянных фильтров и их обозначения часто менялись. По ГОСТ 9775-69 класс фильтра зависит от размера пор (табл. 8).
Типы стеклянных воронок и тиглей с пористыми фильтрами представлены на рис. 123.
Кроме стеклянных изделий с фильтрами для жидкостей изготовляются также изделия с фильтрами для фильтрования и промывания газов.
Выпускаются также фильтрующие воронки с термостатированной трубкой и термостатированной рубашкой (рис. 124). Воронки с электроподогревом предназначаются для фильтрования в нагретом состоянии кристаллизующихся и вязких при комнатной температуре растворов и суспензий. Подогрев фильтрующей воронки до 130°С исключает застывание раствора, и фильтрование протекает быстро.
Основной элемент фильтрующей воронки с электроподогревом и термостатированной трубкой - стеклянный фильтр диаметром 40 мм со впаянной тонкостенной стеклянной трубкой, куда заключен электронагреватель мощностью 30 Вт. Воронки выпускаются с фильтрами, размер которых составляет 40, 100, 160 мкм.
В фильтрующей воронке с подогревом термостатирование обеспечивается проточным теплоносителем. Объем воронки над фильтром с термостатированной трубкой - 80 мл, с термостатируемой рубашкой - 58 мл.
Для отделения жидкости от твердого вещества применяют обратную погружную фильтрующую воронку (рис. 123, г). Фильтр погружают в жидкость, и фильтрат поступает в приемник, с которым фильтр соединен. С помощью этого устройства удобно проводить фильтрование при пониженной температуре, поддерживая низкую температуру фильтруемой смеси посредством охлаждающей бани.
Чтобы отделить малые количества веществ, пользуются воронкой со стеклянным «гвоздиком», который покрывают круглым кусочком фильтровальной бумаги. Для этого конец стеклянной палочки размягчают в пламени горелки и затем расплющивают его, прижимая к ровной горизонтальной поверхности металлической пластинки. Необходимо, чтобы фильтр плотно прилегал к «гвоздику», а края фильтра на 1-2 мм загибались вдоль стенки воронки. Приемником фильтрата служит пробирка для фильтрования (с боковым отводом).
Для фильтрования веществ с низкой температурой плавления или хорошо растворимых при комнатной температуре, пользуются разрежением при охлаждении. В случае малых количеств осадка воронку и раствор предварительно охлаждают в холодильном шкафу. В других случаях воронку Бюхнера встраивают в склянку с отрезанным дном, заполняя последнюю льдом или охлаждающей смесью.
При фильтровании в атмосфере инертного газа пользуются установками, изображенными на рис. 125.
Аналитические аэрозольные фильтры АФА
Для исследования и контроля аэрозолей, содержащихся в воздухе или других газах, служат фильтры АФА. Фильтры АФА состоят из отдельного или наклеенного на опорное кольцо фильтрующего элемента и защитных бумажных колец с выступами.
В качестве фильтрующего элемента используется фильтрующий материал ФП (фильтр Петрянова) из ультратонких полимерных волокон (ацетилцеллюлозы, перхлорвинила, полистирола). Рабочая поверхность круглого сечения фильтра 3, 10, 20 и 160 см2.
Центрифугирование
Центрифугирование - один из методов разделения неоднородных систем (жидкость - жидкость, жидкость - твердые частицы); в роторах под действием центробежных сил. Центрифугирование выгодно применять, если фильтруемые вещества забивают поры фильтра, портятся при соприкосновении с фильтрующим материалом или мелкодисперсны.
Центрифугирование производят в особых аппаратах, называемых центрифугами. Основная часть центрифуги - ротор, вращающийся с большой скоростью.
Типы центрифуг многочисленны; их подразделяют прежде всего по величине фактора разделения. Он равен отношению ускорения центробежного поля, развиваемого в центрифуге, к ускорению силы тяжести. Фактор разделения - величина безразмерная. Разделяющее действие центрифуги возрастает пропорционально фактору разделения.
Фактор разделения у выпускаемых отечественной промышленностью центрифуг с электрическим приводом варьируется в пределах от 1 600 до 300 000, а частота вращения ротора - от 1000 до 50 000 об/мин.
Неоднородные системы в центрифугах разделяют либо отстаиванием, либо фильтрованием. В зависимости от этого центрифуги бывают со сплошным ротором либо с дырчатым, покрытым фильтрующим материалом.
Центрифугирование отстаиванием производят для осветления жидкости, содержащей взвешенные твердые частицы, или же для осаждения твердой фазы. Оно слагается из осаждения твердой фазы, уплотнения осадка и выделения надосадочной жидкости.
В лабораторной практике применяют различные типы центрифуг: с ручным или электрическим приводом, настольные (переносные), передвижные и стационарные. По величине фактора разделения центрифуги подразделяются на обычные (с фактором разделения меньше 3500), суперцентрифуги и ультрацентрифуги (с фактором разделения не менее 3500). Обычные центрифуги используют преимущественно для разделения низкодисперсных (крупность больше 10-50 мкм) суспензий различной концентрации. Суперцентрифуги, в основном, применяют для разделения эмульсий и высокодисперсных суспензий (крупность меньше 10 мкм). Для разделения и исследования высокодисперсных систем и высокомолекулярных соединений распространены аналитические и препаративные ультрацентрифуги с фактором разделения более 100 000. Аналитические центрифуги используются для определения молекулярной массы и степени полимеризации высокомолекулярных соединений, препаративные - для выделения веществ из растворов, которые в обычных условиях находятся в коллоидном состоянии или в виде неразделимых суспензий (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды).
Ротор ультрацентрифуги вращается, как правило, в вакуумной камере при охлаждении (рефрижераторные центрифуги), Скорость и время вращения ротора, а также температурный режим центрифугирования контролируются электронными устройствами.
Обрабатываемый раствор помещают в специальный сосуд, который затем вращают с высокой скоростью на роторе центрифуги. При этом компоненты смеси под действием центробежной силы распределяются слоями на различную глубину (в соответствии с массами частиц); наиболее тяжелые частицы прижимаются ко дну сосуда.
При пользовании пробирочными малогабаритными переносными центрифугами с ручным или электрическим приводом суспензию помещают в стеклянные или пластмассовые пробирки, которые вращаются вокруг главной оси, будучи подвешенными на цапфах. Пробирочные центрифуги для периодического разделения малых количеств вещества могут быть двух типов. В одних пробирки удерживаются цапфами на роторе и принимают горизонтальное положение при вращении, в других они жестко укреплены под определенным углом к оси вращения (угловые роторы).
На рис. 126 показано положение пробирок при центрифугировании в угловом роторе и в роторе с качающимися стаканами.
После остановки центрифуги прозрачную жидкую фазу (фугат) сливают или отбирают при помощи пипетки. Осадок промывают и снова центрифугируют. Если из пробирки нужно извлечь максимальное количество осадка, то фугат отбрасывают, а осадок высушивают в вакуум-эксикаторе, не вынимая его из центрифужной стеклянной пробирки.
При пользовании пробирочными центрифугами пробирки из толстостенного стекла или из синтетического материала вставляют в предохранительные металлические стаканы. Дно стеклянных пробирок предохраняют прокладками из резины. Стеклянные пробирки можно наполнять до половины объема, а пробирки из синтетических материалов при больших частотах вращения ротора (5000 об/мин) следует наполнять почти доверху для того, чтобы они под действием центробежной силы не деформировались. Для обеспечения безопасности работы необходимо очень точно уравновешивать пробирки с центрифугируемой суспензией. Нарушение равновесия при больших частотах вращения может привести к повреждению ротора. Учитывая, что летучие растворители при центрифугировании могут испаряться, пробирки лучше закрывать пробками.
Роторы лабораторных пробирочных центрифуг, за исключением ручных, помещены в предохранительные металлические чехлы (крышки), чтобы не возникала угроза опасности для работающих, если пробирка со стаканом сорвется с подвесок.
Необходимо строго соблюдать указания, приводимые в заводской инструкции для данной центрифуги, нельзя превышать частоту вращения ротора, указанную в инструкции. Приводить центрифугу в движение можно лишь при закрытой предохранительной крышке; открывать крышку разрешается только после полной остановки центрифуги.
Ручная центрифуга РЦ-4. Эта центрифуга предназначена для разделения жидкостей различной плотности или для отделения от жидкостей взвешенных или взмученных в них частиц. Основные части центрифуги: чугунный корпус, внутри которого смонтированы шестерни (червячная передача), пробиркодержатель, рукоятка и струбцина. На шарнирных подвесках пробиркодержателя имеются четыре гильзы, изготовленные из карболита. Жидкости и твердые частицы, обладающие различной плотностью, при вращении распределяются в разных местах пробирки. Разделение можно проводить одновременно в четырех пробирках. За один оборот рукоятки пробиркодержатель делает восемь оборотов. Для работы центрифуга крепится зажимом на крышке лабораторного стола или на специальной подставке.
Лабораторная настольная центрифуга ЦЛН-2. Центрифуга ЦЛН-2 работает с ротором углового типа РУ 6х10. Максимальный объем центрифугируемого материала 60 см3. Частота вращения ротора 3000-8000 об/мин; интервал частоты вращения, регулируемый переключателем, равен 1000 оборотов. Фактор разделения достигает 5 500. Время разгона ротора до максимальной частоты вращения 10 мин; время торможения не более 8 мин. Время непрерывной работы 60 мин; минимальный обязательный перерыв 15 мин. Рабочая камера центрифуги закрывается крышкой с самозакрывающимся устройством. Масса центрифуги 8 кг.
При работе с центрифугой ЦЛН-2 запрещается: работать без заземления; увеличивать частоту вращения свыше 8000 об/мин; работать с открытыми крышками ротора и центрифуги; работать со стеклянными пробирками при частоте вращения ротора свыше 4000 об/мин; размещать заполненные центрифугируемым материалом пробирки не диаметрально противоположно.
Разность массы диаметрально расположенных пробирок, заполненных центрифугируемым материалом, не должна превышать 0,5 г. Плотность жидкости, разделяемой в пробирках из полимерных материалов, не должна быть более 2 г/см3, в стеклянных пробирках - не более 1,5 г/см3.
Угловая малогабаритная центрифуга ЦУМ-1. Центрифуга имеет ротор-крестовину для одновременного центрифугирования жидкостей в четырех пробирках вместимостью по 25 мл, четырех по 10 мл и восьми по 5 мл. Частота вращения ротора от 2000 до 8000 об/мин регулируется ступенчато. Фактор разделения достигает 6000. Время разгона ротора 8-10 мин. Центрифуга снабжена электрическими часами, дающими возможность устанавливать время центрифугирования от 0 до 60 мин, с последующим автоматическим торможением. Масса центрифуги 16 кг.
Лекция №5
Разделение жидких неоднородных смесей эффективно проводится методом центрифугирования, основанным на использовании центробежной силы. Аппараты, в которых жидкие неоднородные смеси разделяются под действием центробежной силы, называются центрифугами.
Метод центрифугирования широко используют в различных областях техники; число типов и конструкций центрифуг весьма велико.
Основной частью центрифуги является барабан (ротор со сплошными или перфорированными стенками), вращающийся с большой скоростью на вертикальном или горизонтальном валу. Разделение неоднородных смесей в центрифугах может производиться либо по принципу отстаивания, либо по принципу фильтрации. В первом случае используют барабаны со сплошными стенками, во втором - с отверстиями; барабаны с отверстиями покрываются фильтром. Если стенки барабана сплошные, то материал под действием центробежной силы располагается слоями соответственно удельному весу, причем непосредственно у стенок барабана располагается слой материала с большим удельным весом. Если стенки барабана имеют отверстия и снабжены на внутренней поверхности фильтрующей перегородкой, например фильтровальной тканью, то твердые частицы смеси остаются на фильтрующей перегородке, а жидкая фаза проходит через поры твердого осадка и фильтрующей перегородки и удаляется из барабана. Жидкая фаза, отделяемая на центрифуге, называется фугатом .
Центробежная сила; фактор разделения. При вращении барабана центрифуги и находящейся в нем жидкости возникает центробежная сила как сила инерции.
С=m W 2 / r (1)
m -вес вращающегося тела (жидкости) в кгс;
r -радиус вращения в м
W -окружная скорость вращения в м/с;
Окружная скорость вращения определяется как:
W=ω r = 2 π n r/60 (2)
п -число оборотов в минуту;
ω-угловая скорость вращения в радианах
g-ускорение силы тяжести в м/сек 2 , если m=G/g, тогда центробежная сила С, действующая на вращающееся тело с массой m и весом G, равна C= G(2π n r/60) 2 /rg Или C ≈ G n 2 r/900 (3)
Уравнение (2,3) показывает, что увеличение центробежной силы легче достигается увеличением числа оборотов, чем увеличением диаметра барабана. Барабаны небольшого диаметра, но с большим числом оборотов могут развить большую центробежную силу, чем барабаны большого диаметра, но при небольшом числе оборотов.
Таким образом, центробежная сила, действующая на частицу, может быть больше силы тяжести во столько раз, во сколько ускорение центробежной силы больше ускорения свободного падения. Отношение этих ускорений называют фактором разделения и обозначают Кр:
W 2 / r – ускорение центробежной силы.
Приняв G=1н, получим: Кр=n 2 r /900
Например, для центрифуги с ротором диаметром 1000 мм (r=0,5 м) вращающимся со скоростью n=1200 об/мин, фактор разделения составит 800. Разделяющее действие центрифуги растет пропорционально величине Кр.
Значение К для циклонов имеет порядок сотен. А для центрифуг – около 3000, таким образом, движущая сила процесса осаждения в циклонах и центрифугах на 2-3 порядка больше, чем в отстойниках. Благодаря этому производительность циклонов и центрифуг выше производительности отстойников, и в них можно эффективно отделять мелкие частицы: в центрифугах размером порядка 1мкм. В циклонах – порядка 10 мкм.
Из сравнения уравнений видно, что фактор разделения К р численно равен центробежной силе, развивающейся при вращении тела весом 1 кг.
Характеристика процессов центрифугирования . Как было указано выше, центрифугирование можно проводить по принципу отстаивания (в сплошных барабанах) или по принципу фильтрации (в дырчатых барабанах). По своей физической сущности оба процесса отличаются друг от друга. Кроме того, имеются отдельные разновидности каждого из этих процессов, которые определяются содержанием твердой фазы и степенью ее дисперсности, а также физическими свойствами суспензии.
Центрифугирование в отстойных барабанах производят как для очистки жидкостей от загрязнений, содержащихся в небольших количествах (осветление жидкостей), так и для разделения суспензий, содержащих значительное количество твердой фазы (отстойное центрифугирование).
Центрифугирование в отстойных барабанах в общем случае складывается из двух физических процессов: осаждения твердой фазы (процесс проходит по законам гидродинамики) и уплотнения осадка; к последнему процессу применимы основные закономерности механики грунтов (дисперсных сред).
До некоторого предела концентрации твердой фазы (равного ориентировочно 3-4% по объему) ее осаждение в отстойном барабане протекает без образования поверхности раздела между твердым веществом и жидкостью. При повышении концентрации такая поверхность образуется вследствие укрупнения и осаждения находящихся в жидкости твердых частиц.
Процесс центрифугирования в отстойных барабанах принципиально отличается от процесса разделения в отстойниках. В последних скорость осаждения практически можно считать постоянной, так как процесс происходит в поле тяжести, ускорение которого не зависит от координат падающей частицы.
Ускорение же поля центробежных сил является величиной переменной и зависит при постоянной угловой скорости от радиуса вращения rчастицы. Кроме того, силовые линии центробежного поля не параллельны друг другу и, следовательно, направление действия центробежных сил будет неодинаково для разных частиц (не лежащих на одном радиусе вращения).
Поэтому закономерности процессов отстаивания нельзя распространять на процесс центрифугирования в отстойных барабанах.
Разделяющая способность отстойных центрифуг характеризуется индексом производительности (сигма) Σ, который является произведением площади цилиндрической поверхности осаждения F в роторе на фактор разделения Кр.
Σ=F Кр (1), Кр= W2/rg ≈n2 r/900 , откуда Σ /F=Кр (2)
Учитывая, что фактор разделения выражает отношение скоростей отстаивания частиц в отстойной центрифуге и отстойнике, в соответствии с равенством (2) величину Σ следует считать равной площади отстойника, эквивалентного по производительности для данной суспензии рассматриваемой центрифуге. Индекс производительности отражает влияние всех конструктивных особенностей осадительной центрифуги, определяющих ее разделительную способность.
При определении производительности отстойных центрифуг периодического действия необходимо учитывать затраты времени на пуск, торможение и разгрузку центрифуги Определение производительности фильтрующей центрифуги так же сложно, как и определение производительности любого фильтра.
Еще более сложным является процесс центрифугирования в фильтрующих барабанах . Процесс протекает в три стадии:
образование осадка, уплотнение осадка и, наконец, удаление из пор осадка жидкости, удерживаемой капиллярными и молекулярными силами.
Вследствие этого весь процесс центробежной фильтрации не может быть отождествлен с обычной фильтрацией, происходящей под действием сил тяжести. Лишь первый его период принципиально близок к обычной фильтрации и отличается от нее только величиной гидравлического напора жидкости, протекающей через слой осадка под действием центробежных сил. В этот период влага в осадке находится в свободной форме и удаляется из него наиболее интенсивно. Второй период аналогичен соответствующему периоду при отстойном центрифугировании и, наконец, третий характеризуется проникновением воздуха в уплотненный осадок, т. е. механической сушкой осадка
Длительность указанных выше периодов зависит от физических свойств и концентрации суспензий, а также от характеристики центрифуги.
Сложность и многообразие процессов центрифугирования затрудняет разработку теории процесса (особенно его кинетика) и точных методов расчета центрифуг.
Производительность центрифуг . Обычно производительность центрифуг выражают объемом суспензии, поступающей в центрифугу в единицу времени (л/час), или весом осадка, получающегося после центрифугирования (кг/час).
Описание презентации Центрифугирование. Его использование в разных направлениях биологии. по слайдам
Центрифугирование. Его использование в разных направлениях биологии. Выполнил: Левиков, Д. А.
Центрифугирование Это разделение механических смесей на составные части действием центробежной силы. Приборы, применяемые для этой цели, называют центрифугами. Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по величине центробежные силы, под действием которых происходит разделение механических смесей, например осаждение взвешенных в жидкости частиц.
Процессы, происходящие в центрифуге В центрифугах разделяют следующие процессы: 1)Центробежное фильтрование. 2)Центробежное отстаивание. 3)Центробежное осветление.
Центробежное фильтрование Центробежное фильтрование представляет собой процесс разделения суспензий в центрифугах с дырчатыми барабанами. Внутренняя поверхность такого барабана покрыта фильтровальной тканью. Суспензия центробежной силой отбрасывается к стенкам барабана, при этом твёрдая фаза остаётся на поверхности ткани, а жидкость под действием центробежной силы проходит сквозь слой осадка и ткань удаляется наружу через отверстия в барабане. Центробежное фильтрование обычно складывается из трёх последовательных физических процессов: 1)фильтрование с образованием осадка; 2)уплотнение осадка; 3)удаление из осадка жидкости, удерживаемой молекулярными силами;
Центробежное отстаивание Центробежное отстаивание — процесс разделения суспензий в центрифугах, имеющих барабаны со сплошными стенками. Суспензия вводится в нижнюю часть барабана и под действием центробежной силы отбрасывается к стенкам. У стенок образуется слой осадка, а жидкость образует внутренний слой и вытесняется из барабана поступающей на разделение суспензией. Жидкость при этом поднимается кверху, переливается через закраину барабана и удаляется наружу. При этом происходит два физических процесса: 1)Осаждение твёрдой фазы. 2)Уплотнение осадка.
Центробежное осветление Центробежное осветление — процесс разделения тонких суспензий и коллоидных растворов. Так же проводится в сплошных барабанах. По физической сущности центробежное осветление представляет собой процесс свободного осаждения твёрдых частиц в поле центробежных сил. В барабанах со сплошными стенками производится так же разделение эмульсий. Под действием центробежной силы компоненты эмульсии в соответствии с плотностью располагаются в виде разграниченных слоев: наружного слоя жидкости с большей плотностью и внутреннего слоя более лёгкой жидкости. Жидкости выводятся из барабана порознь.
В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделенияэритроцитовот плазмы крови, сгустков кровиот сыворотки, плотных частиц от жидкой части мочи и т. д. Для этой цели применяют или ручные центрифуги, или центрифуги с электроприводом, скорость вращения которых можно регулировать. Ультрацентрифуги, скорость вращения роторов которых превышает 40 000 об/мин, применяют обычно в экспериментальной практике для разделения органелл клеток, отделения коллоидных частиц, макромолекул, полимеров.
Метод центрифугирования в цитологии Метод дифференциального центрифугирования используется для фракционирования клеток, т. е. расслоения их содержимого на фракции в зависимости от удельного веса различных органоидов и клеточных включений. Для этого тонко измельченные клетки вращают в специальном аппарате – ультрацентрифуге. В результате центрифугирования компоненты клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь в соответствии со своей плотностью. Более плотные структуры осаждаются при более низких скоростях центрифугирования, а менее плотные – при высоких скоростях. Полученные слои разделяют и изучают отдельно.
Центрифугирование в ботанике и физиологии растений Центрифугирование позволяет получить различные фракции субклеточных частиц и исследовать свойства и функции каждой фракции в отдельности. Например, из листьев шпината можно выделить хлоропласты, отмыть их с помощью повторного центрифугирования в соответствующей среде от клеточных фрагментов и исследовать их поведение в различных экспериментальных условиях или же определить их химический состав. Далее можно, применяя различные модификации методики, разрушить эти пластиды и выделить посредством дифференциальногоцентрифугирования(повторного осаждения частиц при различных величинах ускорения) составляющие их элементы. Таким путем удалось показать, что пластиды содержат структуры, отличающиеся очень упорядоченным строением, - так называемые граны; все граны находятся внутри ограничивающей хлоропласт мембраны (оболочка хлоропласта). Достоинства этого метода просто неоценимы, поскольку он позволяет выявить существование функциональных субъединиц, входящих в состав более крупных субклеточных частиц; в частности, используя метод дифференциального центрифугирования, удалось показать, что граны являются основным структурным элементом хлоропласта.
Метод центрифугирования в вирусологии Метод центрифугирования в градиенте плотности Брак-ке можно использовать как для выделения, так и для получения количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось, этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время широко используется в области вирусологии и молекулярной биологии. При проведении исследований методом центрифугирования в градиенте плотности центрифужную пробирку частично наполняют раствором, плотность которого уменьшается в направлении от дна к мениску. Для создания градиента при фракционировании вирусов растений наиболее часто используют сахарозу. Перед началом центрифугирования частицы вируса могут быть либо распределены во всем объеме раствора, либо нанесены на вершину градиента. Бракке предложил три различных приема центрифугирования в градиенте плотности. При изопикпическом (равновесном) центрифугировании процесс продолжается до тех пор, пока все частицы в градиенте не достигнут уровня, где плотность среды равна их собственной плотности. Таким образом, фракционирование частиц происходит в этом случае в соответствии с различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают достаточной плотностью для изопикнического разделения многих вирусов. При скоростном зональном центрифугировании вирус сначала наносят па предварительно созданный градиент. Частицы каждого типа седиментируют при, этом через градиент в виде зоны, или полосы, со скоростью, зависящей от их размера, формы и плотности. Центрифугирование при этом заканчивают, когда частицы еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное центрифугирование сходно со скоростным зональным центрифугированием, по в этом случае центрифугирование продолжается до достижения изопикнического состояния. Роль градиента плотности при скоростном центрифугировании заключается в том, чтобы препятствовать конвекции я фиксировать различные виды молекул в определенных зонах. Теория центрифугирования в градиенте плотности сложна и не совсем понятна. На практике же это простой и изящный метод, который широко применяется при работе с вирусами растений.
Трудности в использовании метода центрифугирования Применение метода дифференциального центрифугирования сопряжено со многими методическими трудностями. Во первых, при выделении частиц можно повредить их структуру. Поэтому потребовалось разработать специальные методы разрушения клеток, которые бы не вызывали повреждения структуры субклеточных фракций. Во вторых, поскольку субклеточные частицы обладают мембранами, в процессе их выделения могут возникать разнообразные осмотические эффекты. Следовательно, для того чтобы ультраструктура исследуемых объектов не была разрушена еще при их выделении, необходимо тщательно подбирать состав среды, в которой производится разрушение клеток и осаждение частиц. И наконец, отмывание субклеточных частиц (ресуспендирование их в среде и последующее повторное центрифугирование) может приводить к потере некоторых содержащихся в них веществ, которые под действием сил диффузии переходят в раствор. В связи с этим иногда бывает трудно понять, какие из малых молекул действительно являются элементами исследуемых структур, а какие просто были адсорбированы их поверхностью в процессе выделения. Такое положение затрудняет точное определение некоторых функциональных свойств выделенных объектов.
Центрифугирование
Это разделение механических смесей на составные части
действием центробежной силы. Приборы, применяемые для этой
цели, называют центрифугами.
Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в
нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с
большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по
величине центробежные силы, под действием которых
происходит разделение механических смесей, например
осаждение взвешенных в жидкости частиц.
Процессы, происходящие в центрифуге
В центрифугах разделяют следующие процессы:1)Центробежное фильтрование.
2)Центробежное отстаивание.
3)Центробежное осветление.
Центробежное фильтрование
Центробежное фильтрование представляет собойпроцесс разделения суспензий в центрифугах с
дырчатыми барабанами. Внутренняя поверхность
такого барабана покрыта фильтровальной тканью.
Суспензия центробежной силой отбрасывается к
стенкам барабана, при этом твёрдая фаза остаётся на
поверхности ткани, а жидкость под действием
центробежной силы проходит сквозь слой осадка и
ткань удаляется наружу через отверстия в барабане.
Центробежное фильтрование обычно складывается из
трёх последовательных физических процессов:
1)фильтрование с образованием осадка;
2)уплотнение осадка;
3)удаление из осадка жидкости, удерживаемой
молекулярными силами;
Центробежное отстаивание
Центробежное отстаиваниеЦентробежное отстаивание - процесс разделения
суспензий в центрифугах, имеющих барабаны со
сплошными стенками. Суспензия вводится в нижнюю
часть барабана и под действием центробежной силы
отбрасывается к стенкам. У стенок образуется слой
осадка, а жидкость образует внутренний слой и
вытесняется из барабана поступающей на разделение
суспензией. Жидкость при этом поднимается кверху,
переливается через закраину барабана и удаляется
наружу.
При этом происходит два физических процесса:
1)Осаждение твёрдой фазы.
2)Уплотнение осадка.
Центробежное осветление
Центробежное осветление - процесс разделениятонких суспензий и коллоидных растворов. Так
же проводится в сплошных барабанах.
По физической сущности центробежное
осветление представляет собой процесс
свободного осаждения твёрдых частиц в поле
центробежных сил.
В барабанах со сплошными стенками
производится так же разделение эмульсий. Под
действием центробежной силы компоненты
эмульсии в соответствии с плотностью
располагаются в виде разграниченных слоев:
наружного слоя жидкости с большей плотностью
и внутреннего слоя более лёгкой жидкости.
Жидкости выводятся из барабана порознь. В клинических и санитарногигиенических лабораториях
центрифугирование используют
для отделения эритроцитов от
плазмы крови, сгустков крови от
сыворотки, плотных частиц от
жидкой части мочи и т. д. Для
этой цели применяют или
ручные центрифуги, или
центрифуги с электроприводом,
скорость вращения которых
можно регулировать.
Ультрацентрифуги, скорость
вращения роторов которых
превышает 40 000 об/мин,
применяют обычно в
экспериментальной практике
для разделения органелл
клеток, отделения коллоидных
частиц, макромолекул,
полимеров.
Использование центрифугирования в паразитологии
Метод используется для дифференцировки сложнойкровяной смеси, мочи или кала, с последующим
выделением из нее гельминтов для дальнейшего
изучения под микроскопом и фиксации материала. В
процессе центрифугирования имеющиеся в пробе
паразиты проходят через фильтр и скапливаются в
нижнем коническом отсеке пробирки. Сетка фильтра
со специально подобранными по размеру ячейками
в пробирке расположена вертикально, в результате
чего происходит горизонтальная (латеральная)
фильтрация пробы. В результате чего, грубые
частицы непереваренной пищи, клетчатка оседают в
смесительной камере, а паразиты и их яйца
беспрепятственно проходят через фильтр. Таким
образом, паразиты концентрируются в
поверхностном слое мелкодисперсного осадка, и
врачу-лаборанту остается только аккуратно отобрать
образец для микроскопирования с помощью
автоматической пипетки и нанести его на
предметное стекло.
Метод центрифугирования в цитологии
Метод дифференциальногоцентрифугирования используется для
фракционирования клеток, т. е. расслоения их
содержимого на фракции в зависимости от удельного
веса различных органоидов и клеточных включений.
Для этого тонко измельченные клетки вращают в
специальном аппарате – ультрацентрифуге. В
результате центрифугирования компоненты клеток
выпадают в осадок из раствора, располагаясь в
соответствии со своей плотностью. Более плотные
структуры осаждаются при более низких скоростях
центрифугирования, а менее плотные – при высоких
скоростях. Полученные слои разделяют и изучают
отдельно.
10. Центрифугирование в ботанике и физиологии растений
Центрифугирование позволяет получить различныефракции субклеточных частиц и исследовать
свойства и функции каждой фракции в
отдельности. Например, из листьев шпината можно
выделить хлоропласты, отмыть их с помощью
повторного центрифугирования в соответствующей
среде от клеточных фрагментов и исследовать их
поведение в различных экспериментальных
условиях или же определить их химический состав.
Далее можно, применяя различные модификации
методики, разрушить эти пластиды и выделить
посредством
дифференциального центрифугирования (повторно
го осаждения частиц при различных величинах
ускорения) составляющие их элементы. Таким
путем удалось показать, что пластиды содержат
структуры, отличающиеся очень упорядоченным
строением, - так называемые граны; все граны
находятся внутри ограничивающей хлоропласт
мембраны (оболочка хлоропласта). Достоинства
этого метода просто неоценимы, поскольку он
позволяет выявить существование
функциональных субъединиц, входящих в состав
более крупных субклеточных частиц; в частности,
используя метод
11. Метод центрифугирования в вирусологии
Метод центрифугирования в градиенте плотности Брак-ке можноиспользовать как для выделения, так и для получения
количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось,
этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время
широко используется в области вирусологии и молекулярной
биологии. При проведении исследований методом
центрифугирования в градиенте плотности центрифужную пробирку
частично наполняют раствором, плотность которого уменьшается в
направлении от дна к мениску. Для создания градиента при
фракционировании вирусов растений наиболее часто используют
сахарозу. Перед началом центрифугирования частицы вируса могут
быть либо распределены во всем объеме раствора, либо нанесены на
вершину градиента. Бракке предложил три различных приема
центрифугирования в градиенте плотности. При изопикпическом
(равновесном) центрифугировании процесс продолжается до тех пор,
пока все частицы в градиенте не достигнут уровня, где плотность
среды равна их собственной плотности. Таким образом,
фракционирование частиц происходит в этом случае в соответствии с
различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают
достаточной плотностью для изопикнического разделения многих
вирусов. При скоростном зональном центрифугировании вирус
сначала наносят па предварительно созданный градиент. Частицы
каждого типа седиментируют при, этом через градиент в виде зоны,
или полосы, со скоростью, зависящей от их размера, формы и
плотности. Центрифугирование при этом заканчивают, когда частицы
еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное
центрифугирование сходно со скоростным зональным
центрифугированием, по в этом случае центрифугирование
12. Трудности в использовании метода центрифугирования
Применение метода дифференциального центрифугированиясопряжено со многими методическими трудностями. Во первых, при
выделении частиц можно повредить их структуру. Поэтому
потребовалось разработать специальные методы разрушения клеток,
которые бы не вызывали повреждения структуры субклеточных
фракций. Во вторых, поскольку субклеточные частицы обладают
мембранами, в процессе их выделения могут возникать
разнообразные осмотические эффекты. Следовательно, для того
чтобы ультраструктура исследуемых объектов не была разрушена
еще при их выделении, необходимо тщательно подбирать состав
среды, в которой производится разрушение клеток и осаждение
частиц. И наконец, отмывание субклеточных частиц
(ресуспендирование их в среде и последующее повторное
центрифугирование) может приводить к потере некоторых
содержащихся в них веществ, которые под действием сил диффузии
переходят в раствор.
В связи с этим иногда бывает трудно понять, какие из малых молекул
действительно являются элементами исследуемых структур, а какие
просто были адсорбированы их поверхностью в процессе выделения.
Такое положение затрудняет точное определение некоторых
функциональных свойств выделенных объектов.