Tarchevsky I.A. Signalni sistemi biljnih ćelija

Djelovanje preparata elicitor je zbog prisustva posebnih biološki aktivnih supstanci u njihovom sastavu. Prema savremenim shvatanjima, signalne supstance ili elicitori su biološki aktivna jedinjenja različite prirode, koja u vrlo malim dozama, merenim u mi-, mikro-, a u nekim slučajevima i nanogramima, izazivaju kaskade različitih reakcija biljaka na genetičku, biohemijsku i fiziološkim nivoima. Njihov utjecaj na fitopatogene organizme ostvaruje se utjecajem na genetski aparat stanica i promjenom fiziologije same biljke, dajući joj veću održivost, otpornost na različite negativne faktore okoline.

Odnos biljaka sa spoljnim svetom, kao visokoorganizovanim elementima ekoloških sistema, ostvaruje se kroz percepciju fizičkih i hemijskih signala koji dolaze spolja i korigujući sve procese njihovog života uticajem na genetske strukture, imuni i hormonalni sistem. Proučavanje biljnih signalnih sistema jedno je od najperspektivnijih područja moderne ćelijske i molekularne biologije. Poslednjih decenija naučnici su posvetili veliku pažnju proučavanju signalnih sistema odgovornih za otpornost biljaka na fitopatogene.

Biohemijski procesi koji se odvijaju u biljnim ćelijama striktno su koordinirani integritetom organizma, što je upotpunjeno njihovim adekvatnim odgovorima na tokove informacija povezanim sa različitim efektima biogenih i tehnogenih faktora. Ova koordinacija se odvija zahvaljujući radu signalnih lanaca (sistema), koji su utkani u signalne mreže ćelija. Signalni molekuli uključuju većinu hormona, po pravilu, ne prodiru u ćeliju, ali stupaju u interakciju s receptorskim molekulima vanjskih ćelijskih membrana. Ovi molekuli su integralni membranski proteini, čiji polipeptidni lanac prodire u debljinu membrane. Različiti molekuli koji iniciraju transmembransku signalizaciju aktiviraju receptore u nano-koncentracijama (10-9-10-7 M). Aktivirani receptor prenosi signal na unutarćelijske mete - proteine, enzime. U tom slučaju se modulira njihova katalitička aktivnost ili provodljivost jonskih kanala. Kao odgovor na to, formira se određeni ćelijski odgovor, koji se u pravilu sastoji u kaskadi uzastopnih biokemijskih reakcija. Pored proteinskih glasnika, transdukcija signala može uključivati i relativno male molekule glasnika koji su funkcionalno posrednici između receptora i ćelijskog odgovora. Primjer intracelularnog glasnika je salicilna kiselina, koja je uključena u indukciju stresa i imunološke reakcije u biljkama. Nakon isključivanja signalnog sistema, glasnici se brzo dijele ili (u slučaju Ca katjona) ispumpavaju kroz jonske kanale. Dakle, proteini formiraju neku vrstu „molekularne mašine“, koja, s jedne strane, percipira vanjski signal, a s druge strane ima enzimsku ili drugu aktivnost koju modelira ovaj signal.

U višećelijskim biljnim organizmima prijenos signala se odvija preko nivoa ćelijske komunikacije. Ćelije "govore" jezikom hemijskih signala, što omogućava homeostazu biljke kao integralnog biološkog sistema. Genomski i stanični signalni sistemi čine složen samoorganizirajući sistem ili neku vrstu "biokompjutera". Čvrsti nosilac informacija u njemu je genom, a signalni sistemi igraju ulogu molekularnog procesora koji obavlja funkcije operativne kontrole. Za sada imamo samo najopštije informacije o principima rada ovog izuzetno složenog biološkog entiteta. Na mnogo načina, molekularni mehanizmi signalnih sistema i dalje ostaju nejasni. Među rješenjima mnogih pitanja potrebno je dešifrirati mehanizme koji određuju privremenu (prolazna) prirodu uključivanja određenih signalnih sistema, a ujedno i dugoročnu memoriju njihovog uključivanja, koja se manifestuje u posebno u sticanju sistemskog produženog imuniteta.

Postoji dvosmjerna veza između signalnih sistema i genoma: s jedne strane, enzimi i proteini signalnih sistema su kodirani u genomu, s druge strane, signalni sistemi su pod kontrolom genoma, eksprimirajući neke gene, a potiskujući druge. . Ovaj mehanizam uključuje prijem, transformaciju, umnožavanje i prijenos signala u promotorske regije gena, programiranje ekspresije gena, promjene u spektru sintetiziranih proteina i funkcionalni odgovor ćelije, na primjer, indukciju imuniteta na fitopatogene.

Razna organska jedinjenja-ligandi i njihovi kompleksi mogu djelovati kao signalne molekule ili elicitori koji ispoljavaju induktivno djelovanje: aminokiseline, oligosaharidi, poliamini, fenoli, karboksilne kiseline i estri viših masnih kiselina (arahidonska, eikozapentaenska, oleinska, itd.), heterociklična i organoelementna jedinjenja, uključujući neke pesticide, itd.

Sekundarni elicitori koji nastaju u biljnim ćelijama pod dejstvom biogenih i abiogenih stresora i uključeni u ćelijske signalne mreže su fitohormoni: etilen, apscizična, jasmonska, salicilna kiselina i

takođe polipeptid sistemina i neka druga jedinjenja koja izazivaju ekspresiju zaštitnih gena, sintezu odgovarajućih proteina, stvaranje fitoaleksina (specifičnih supstanci koje deluju antimikrobno i izazivaju smrt patogenih organizama i zahvaćenih biljnih ćelija) i, na kraju, , doprinose formiranju sistemske otpornosti biljaka na negativne faktore životne sredine.

Trenutno je najviše proučavano sedam ćelijskih signalnih sistema: cikloadenilat, MAP-kinaza (protein-kinaza aktivirana mitogenom), fosfatidna kiselina, kalcijum, lipoksigenaza, NADPH-oksidaza (superoksid sintaza), NO-sintaza. Naučnici nastavljaju da otkrivaju nove signalne sisteme i njihove biohemijske učesnike.

Kao odgovor na napad patogena, biljke mogu koristiti različite puteve za formiranje sistemske rezistencije, koje pokreću različiti signalni molekuli. Svaki od elicitora, djelujući na vitalnu aktivnost biljne stanice određenim signalnim putem, putem genetskog aparata, izaziva širok spektar reakcija, kako zaštitnih (imunih), tako i hormonalnih, što dovodi do promjene svojstava biljaka. sami sebe, što im omogućava da izdrže čitav niz faktora stresa. Istovremeno, u biljkama se javlja inhibitorna ili sinergijska interakcija različitih signalnih puteva isprepletenih u signalne mreže.

Indukovana rezistencija je po manifestaciji slična genetski određenoj horizontalnoj rezistenciji, s jedinom razlikom što je njena priroda određena fenotipskim promjenama u genomu. Ipak, ima određenu stabilnost i služi kao primjer fenotipske imunokorekcije biljnog tkiva, budući da se kao rezultat tretmana izazivajućim supstancama ne mijenja genom biljke, već samo njegovo funkcioniranje povezano s nivoom aktivnosti zaštitnih tvari. geni.

Na određeni način, efekti koji nastaju tretmanom biljaka imunoinduktorima su povezani sa modifikacijom gena, koja se od nje razlikuje po odsustvu kvantitativnih i kvalitativnih promjena u samom genskom fondu. S umjetnom indukcijom imunoloških odgovora uočavaju se samo fenotipske manifestacije, koje karakteriziraju promjene aktivnosti eksprimiranih gena i prirode njihovog funkcioniranja. Međutim, promene izazvane tretiranjem biljaka fitoaktivatorima imaju određeni stepen stabilnosti, što se manifestuje u izazivanju produženog sistemskog imuniteta, koji se održava 2-3 meseca i duže, kao i u očuvanju stečenog svojstva biljaka tokom 1-2 naredne reprodukcije.

Priroda djelovanja određenog elicitora i postignuti efekti u najvećoj mjeri zavise od jačine generiranog signala ili korištene doze. Ove zavisnosti, po pravilu, nisu linearne, već sinusoidne prirode, što može poslužiti kao dokaz prebacivanja signalnih puteva tokom njihovih inhibitornih ili sinergističkih interakcija, visoke težine njihovog adaptogenog delovanja. Naprotiv, tretman ovim supstancama u visokim dozama, u pravilu, izazivao je procese desenzibilizacije u biljkama, naglo snižavajući imunološki status biljaka i dovodeći do povećanja osjetljivosti biljaka na bolesti.

BBK 28.57 T22

Izvršni urednik, dopisni član Ruske akademije nauka.I. Grechkin

Recenzenti:

Doktor bioloških nauka, profesor L.Kh. Gordon doktor bioloških nauka, profesor L.P. Khokhlova

Tarchevsky I.A.

Signalni sistemi biljnih ćelija / I.A. Tarchevsky; [Resp. ed. A.N. Grechkin]. -

M.: Nauka, 2002. - 294 str., ilustr. ISBN 5-02-006411-4

Razmatraju se karike informacionih lanaca interakcije između patogena i biljaka, uključujući elicitore, elicitor receptore, G-proteine, protein kinaze i protein fosfataze, faktore regulacije transkripcije, reprogramiranje ekspresije gena i ćelijski odgovor. Glavna pažnja posvećena je analizi karakteristika funkcionisanja pojedinačnih signalnih sistema biljnih ćelija - adenilat ciklaze, MAP kinaze, fosfatidata, kalcijuma, lipoksigenaze, NADPH oksidaze, NO sintaze i protona, njihovoj interakciji i integraciji u jedinstvenu signalizaciju. mreže. Predložena je klasifikacija proteina izazvanih patogenom prema njihovim funkcionalnim karakteristikama. Prikazani su podaci o transgenim biljkama sa povećanom otpornošću na patogene.

Za specijaliste iz oblasti fiziologije biljaka, biohemičare, biofizičare, genetičare, fitopatologe, ekologe, agrobiologe.

Na mreži AK

Sistemi signalizacije biljnih ćelija /1.A. Tarchevsky; . - M.: Nauka, 2002. - 294 str.; il. ISBN 5-02-006411-4

U knjizi se raspravljalo o članovima signalnih lanaca međudjelovanja patogena i biljke-domaćina, odnosno elicitorima, receptorima, G-proteinima, protein kinazama i protein fosfatazama, reprogramiranju faktora transkripcije ekspresije gena, ćelijskom odgovoru. Glavni dio knjige posvećen je funkcionisanju odvojenih ćelijskih signalnih sistema: adenilat ciklaze, MAP kinaze, fosfatidata, kalcijuma, lipoksigenaze, NADPH-oksidaze, NO-sintaze, protonskih sistema. Razvija se koncept međusobnog povezivanja sistema ćelijske signalizacije i njihove integracije u opštu ćelijsku signalizaciju. Autor je predložio klasifikaciju proteina povezanih s patogenom prema njihovim funkcionalnim svojstvima. Prikazani su podaci o transgenim biljkama sa povećanom otpornošću na patogene.

Za fiziologe, biohemičare, biofizičare, genetičare, fitopatologe, ekologe i agrobiologe

ISBN 5-02-006411-4

(umjetnički dizajn), 2002

Poslednjih godina ubrzano se razvijaju proučavanja molekularnih mehanizama regulacije ekspresije gena pod uticajem promenljivih uslova života. U biljnim ćelijama otkriveno je postojanje signalnih lanaca koji uz pomoć posebnih receptorskih proteina, u većini slučajeva lociranih u plazmalemi, percipiraju signalne impulse, pretvaraju ih, pojačavaju i prenose u genom ćelije, izazivajući reprogramiranje ekspresije gena. i promjene u metabolizmu (uključujući kardinalne) povezane s uključivanjem prethodno "tihih" i isključenjem nekih aktivnih gena. U proučavanju mehanizama djelovanja fitohormona pokazan je značaj ćelijskih signalnih sistema. Prikazana je i odlučujuća uloga signalnih sistema u formiranju sindroma adaptacije (stresa) uzrokovanog djelovanjem abiotičkih i biotičkih stresora na biljke.

Nedostatak preglednih radova koji bi analizirali sve veze različitih signalnih sistema, počevši od karakteristika percipiranih signala i njihovih receptora, transformacije signalnih impulsa i njihovog prijenosa u jezgro, pa do dramatičnih promjena u metabolizmu ćelija. i njihova struktura, naterali su autora da pokuša da popuni ovu prazninu uz pomoć knjige ponuđene čitaocima. Mora se uzeti u obzir da je proučavanje informacionog polja ćelija još uvijek jako daleko od završetka, a mnogi detalji njegove strukture i funkcioniranja ostaju nedovoljno osvijetljeni. Sve to privlači nove istraživače, kojima će generalizacija publikacija o signalnim sistemima biljnih ćelija biti posebno korisna. Nažalost, ne sve recenzije

U popis literature uvršteni su članci eksperimentalne prirode, što je u određenoj mjeri zavisilo od ograničenog obima knjige i vremena za njenu pripremu. Autor se izvinjava kolegama čije istraživanje nije odraženo u knjizi.

Autor se zahvaljuje svojim saradnicima koji su učestvovali u zajedničkom proučavanju signalnih sistema biljnih ćelija. Autor se posebno zahvaljuje profesoru F.G. Karimova, kandidati bioloških nauka V.G. Yakovleva i E.V. Asafova, A.R. Mucha-metshin i vanredni profesor T.M. Nikolaevoj za pomoć u pripremi rukopisa za objavljivanje.

Ovaj rad su finansijski podržali Vodeća naučna škola Ruske Federacije (grantovi 96-15-97940 i 00-15-97904) i Ruska fondacija za osnovna istraživanja (grant 01-04-48-785).

UVOD

Jedan od najvažnijih problema moderne biologije je dešifriranje mehanizama odgovora prokariotskih i eukariotskih organizama na promjene uslova njihovog postojanja, posebno na djelovanje ekstremnih faktora (faktora stresa, odnosno stresora) koji izazivaju stanje stresa u ćelijama.

U procesu evolucije, ćelije su razvile adaptacije koje im omogućavaju da percipiraju, transformišu i pojačavaju signale hemijske i fizičke prirode koji dolaze iz okoline i uz pomoć genetskog aparata reaguju na njih, ne samo da se prilagođavaju promenama. stanja, obnavljaju njihov metabolizam i strukturu, ali i ističu različite hlapljive i neisparljive spojeve u ekstracelularni prostor. Neki od njih imaju ulogu zaštitnih supstanci protiv patogena, dok se drugi mogu smatrati signalnim molekulima koji izazivaju odgovor drugih stanica koje se nalaze na velikoj udaljenosti od mjesta djelovanja primarnog signala na biljke.

Možemo pretpostaviti da se svi ovi adaptivni događaji javljaju kao rezultat promjena u informacionom polju ćelija. Primarni signali uz pomoć različitih signalnih sistema izazivaju reakciju genoma ćelije koja se manifestuje u reprogramiranju ekspresije gena. Zapravo, signalni sistemi reguliraju rad glavnog spremnika informacija - molekula DNK. S druge strane, i sami su pod kontrolom genoma.

Po prvi put u našoj zemlji, E.S. Severin (Severin, Kochetkova, 1991) o životinjskim predmetima i O.N. Kulaeva [Kulaeva et al., 1989; Kulaeva, 1990; Kulaeva i dr., 1992; Kulaeva, 1995;

Burkhanova et al., 1999] - o biljkama.

Monografija predstavljena čitaocima sadrži generalizaciju rezultata proučavanja uticaja biotičkih stresora na funkcionisanje signalnih sistema biljnih ćelija. MAP kinaza, adenilat ciklaza, fosfatidat, kalcij, lipoksigenaza, NADPH oksidaza, NO sintaza i protonski signalni sistemi i njihova uloga u ontogenetskom razvoju biljaka i u oblikovanju odgovora na promjenjive životne uvjete, posebno na djelovanje različitih abiotičkih i biotičkih stresori. Autor je odlučio da se fokusira samo na posljednji aspekt ovog problema - na molekularne mehanizme odgovora biljaka na djelovanje patogena, posebno jer ovaj odgovor uključuje niz fitohormona i rasvjetljavanje karakteristika interakcije signalnih sistema biljnih stanica sa oni privlače veliku pažnju istraživača.

Utjecaj biotičkih stresora dovodi do odgovora biljaka koji je u osnovi sličan odgovoru na abiotičke stresore. Karakterizira ga skup nespecifičnih reakcija, zbog čega se može nazvati adaptacijskim sindromom ili stresom. Naravno, mogu se uočiti i specifične karakteristike odgovora u zavisnosti od vrste stresora, međutim, kako se mjera njegovog uticaja povećava, sve više dolaze do izražaja nespecifične promjene [Meyerson, 1986; Tarčevski, 1993]. Njima je najveću pažnju posvetio N.S. Vvedensky (ideje o parabiozi), D.S. Nasonov i V.Ya. Aleksandrov (ideje o paranekrozi), G. Selye - u radovima posvećenim stresu kod životinja, V.Ya. Aleksandrov - u proučavanju molekularne osnove stresa.

Najznačajnije nespecifične promjene u biotičkom stresu uključuju sljedeće:

1. Faza u razvoju u vremenu odgovora na djelovanje patogena.

2. Povećan katabolizam lipida i biopolimera.

3. Povećanje sadržaja slobodnih radikala u tkivima.

4. Zakiseljavanje citosola praćeno aktivacijom protonske pumpe, čime se pH vraća na prvobitnu vrijednost.

5. Povećanje sadržaja kalcijevih jona u citosolu, praćeno aktivacijom kalcijum ATPaze.

6. Izlaz iz ćelija jona kalijuma i hlora.

7. Pad membranskog potencijala (na plazmalemi).

8. Smanjen ukupni intenzitet sinteze biopolimera i

9. Zaustavljanje sinteze nekih proteina.

10. Povećana sinteza ili sinteza odsutnih takozvanih zaštitnih proteina izazvanih patogenom (hitinaze,(3-1,3-glukanaze, inhibitori proteinaze, itd.).

11. Intenziviranje sinteze komponenti koje jačaju ćelijske zidove - lignin, suberin, kutin, kaloza, protein bogat hidroksiprolinom.

12. Sinteza antipatogenih neisparljivih jedinjenja -

fitoaleksini.

13. Sinteza i izolacija isparljivih baktericidnih i fungicidnih jedinjenja (heksenala, nonenala, terpena i

Dr->- 14. Jačanje sinteze i povećanje sadržaja (ili prema

fenomen) fitohormona stresa - apscizične, jasmonske, salicilne kiseline, etilena, hormona peptidne prirode sistemina.

15. Inhibicija fotosinteze.

16. Preraspodjela ugljika iz |4 CO2, asimilovanog tokom fotosinteze, između različitih jedinjenja - smanjenje uključivanja etikete u visokopolimerna jedinjenja (proteini, skrob) i saharozu i povećanje (češće relativno - kao procenat asimilirani ugljik) - u alaninu, malatu, aspartatu (Tarchevsky, 1964).

17. Pojačano disanje praćeno njegovom inhibicijom. Aktivacija alternativne oksidaze koja mijenja smjer transporta elektrona u mitohondrijima.

18. Poremećaji ultrastrukture - promjena fine granularne strukture jezgra, smanjenje broja polisoma i diktiosoma, oticanje mitohondrija i hloroplasta, smanjenje broja tilakoida u hloroplastima, preuređenje cito-

skelet.

19. Apoptoza (programirana smrt) ćelija izloženih patogenima i susednim ćelijama.

20. Pojava sistemske nespecifične tzv

otpornost na patogene na biljnim mjestima (na primjer, metamerni organi) udaljenim od mjesta utjecaja patogena.

Mnoge od gore navedenih promjena posljedica su „uključenja“ relativno malog broja nespecifičnih signalnih sistema od strane stresora.

Uz sve dublje proučavanje mehanizama odgovora biljaka na patogene, otkrivaju se novi nespecifični odgovori biljnih stanica. To uključuje ranije nepoznate signalne puteve.

Prilikom rasvjetljavanja karakteristika funkcionisanja signalnih sistema, treba imati na umu da su ova pitanja dio općenitijeg problema regulacije funkcionisanja genoma. Treba napomenuti da univerzalnost strukture glavnih nosilaca informacija ćelija različitih organizama - DNK i gena - predodređuje objedinjavanje mehanizama koji služe implementaciji ovih informacija [Grechkin, Tarchevsky, 2000]. To se odnosi na replikaciju i transkripciju DNK, strukturu i mehanizam delovanja ribozoma, kao i mehanizme regulacije ekspresije gena promenom uslova postojanja ćelije koristeći skup uglavnom univerzalnih signalnih sistema. Karike signalnih sistema su takođe u osnovi objedinjene (priroda, pronašavši optimalno strukturno i funkcionalno rešenje nekog biohemijskog ili informacionog problema u svom vremenu, čuva ga i replicira u procesu evolucije). U većini slučajeva, širok spektar hemijskih signala koji dolaze iz okoline hvata se od strane ćelije uz pomoć posebnih "antena" - receptorskih proteinskih molekula koji prodiru kroz ćelijsku membranu i vire iznad njenih površina izvana i iznutra.

njenu stranu. Nekoliko tipova strukture ovih receptora ujedinjeno je u biljnim i životinjskim ćelijama. Nekovalentna interakcija spoljašnjeg regiona receptora sa jednim ili drugim signalnim molekulom koji dolazi iz okoline koja okružuje ćeliju dovodi do promene konformacije receptorskog proteina, koja se prenosi u unutrašnji, citoplazmatski region. U većini signalnih sistema, posredni G-proteini su u kontaktu sa njim - još jedna objedinjena (u smislu svoje strukture i funkcija) karika signalnih sistema. G-proteini obavljaju funkciju pretvarača signala, prenoseći konformacioni impuls signala do startnog enzima specifičnog za određeni signalni sistem. Početni enzimi istog tipa signalnog sistema u različitim objektima su takođe univerzalni i imaju proširene regije sa istom sekvencom aminokiselina. Jedna od najvažnijih objedinjenih karika signalnih sistema su protein kinaze (enzimi koji prenose terminalni ostatak ortofosforne kiseline sa ATP-a na određene proteine), aktivirane produktima početnih signalnih reakcija ili njihovim derivatima. Fosforilirani proteini protein kinazama su sljedeće karike u signalnim lancima. Još jedna objedinjena karika u sistemima ćelijske signalizacije su faktori regulacije proteinske transkripcije, koji su jedan od supstrata reakcija protein kinaze. Struktura ovih proteina je takođe u velikoj meri unificirana, a strukturne modifikacije određuju da li faktori regulacije transkripcije pripadaju jednom ili drugom signalnom sistemu. Fosforilacija faktora regulacije transkripcije uzrokuje promjenu konformacije ovih proteina, njihovu aktivaciju i naknadnu interakciju sa promotorskom regijom određenog gena, što dovodi do promjene intenziteta njegove ekspresije (indukcije ili represije), au ekstremnim slučajevima , na "uključivanje" nekih tihih gena ili "isključivanje" aktivnih. Reprogramiranje ekspresije totaliteta genomskih gena uzrokuje promjenu odnosa proteina u ćeliji, što je osnova njenog funkcionalnog odgovora. U nekim slučajevima, hemijski signal iz vanjskog okruženja može stupiti u interakciju s receptorom koji se nalazi unutar ćelije - u citosolu ili da -

Rice. 1. Šema interakcije vanjskih signala sa ćelijskim receptorima

1, 5, 6 - receptori koji se nalaze u plazmalemi; 2,4 - receptori koji se nalaze u citosolu; 3 - startni enzim signalnog sistema, lokalizovan u plazmalemi; 5 - receptor aktiviran pod uticajem nespecifičnih promena u strukturi lipidne komponente plazmaleme; SIB - proteini inducirani signalom; PGF - faktori regulacije transkripcije proteina; i|/ - promjena membranskog potencijala

isto jezgro (slika 1). U životinjskim ćelijama takvi signali su, na primjer, steroidni hormoni. Ovaj informacioni put ima manji broj intermedijara, te stoga ima manje mogućnosti za regulaciju od strane ćelije.

Metlitsky et al., 1984; Metlitsky i Ozeretskovskaya, 1985; Kursanov, 1988; Ilinskaya et al., 1991; Ozeretskovskaya et al., 1993; Korableva, Platonova, 1995; Chernov et al., 1996; Tarčevski i Černov, 2000].

Posljednjih godina posebna pažnja posvećena je molekularnim mehanizmima fitoimuniteta. To se pokazalo

kada su biljke zaražene, aktiviraju se različiti signalni sistemi koji percipiraju, umnožavaju i prenose signale od patogena do genetskog aparata ćelija, gde se eksprimiraju zaštitni geni, što omogućava biljkama da organizuju i strukturnu i hemijsku zaštitu od patogena. Napredak u ovoj oblasti povezan je sa kloniranjem gena, dešifrovanjem njihove primarne strukture (uključujući regione promotora), strukture proteina koje oni kodiraju, upotrebom aktivatora i inhibitora pojedinih delova signalnih sistema, kao i mutanata i transgenih biljaka sa umetnutim geni odgovorni za sintezu učesnika u prijemu, prenosu i pojačavanju signala. U proučavanju signalnih sistema biljnih ćelija važnu ulogu igra izgradnja transgenih biljaka sa promotorima gena proteina uključenih u signalne sisteme.

Trenutno se na Institutu za biohemiju najintenzivnije proučavaju signalni sistemi biljnih ćelija pod biotičkim stresom. A.N. Bach RAS, Kazanski institut za biohemiju i biofiziku RAN, Institut za fiziologiju biljaka RAN, Filijala Puščino Instituta za bioorgansku hemiju RAN, Centar "Bioinženjering" RAN, Državni univerziteti Moskve i Sankt Peterburga, Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju RAS , Sveruski istraživački institut za fitopatologiju RAS.

"Fiziološka i molekularna patologija biljaka", "Interakcije molekularne biljke i mikroba", "Godišnji pregled fiziologije i patologije biljaka"). Istovremeno, u domaćoj literaturi nema generalizacije radova posvećenih signalnim sistemima ćelija, što je autora dovelo do potrebe da napiše monografiju ponuđenu čitaocima.

PATOGENI I ELICITERI

mikroorganizmi slični mikoplazmi; pečurke (niže:

Plasmodiophoromycetes, Chitridomycetes, Oomycetes: viši: Ascomycetes, Basidi-omycetes, Deuteromycetes).

teze za zaštitne enzime: fenilalanin-amonijak-liaza

I anjonska peroksidaza. Oblici bez krila koji pripadaju ovoj podklasi pojavili su se kao rezultat gubitka ovih organa tokom evolucije krilatih oblika. Podklasa obuhvata 20 redova insekata, među kojima su polifagi koji nemaju biljnu specifičnost, oligofagi i monofagi, kod kojih je izražena specifičnost interakcije između patogena i biljke domaćina. Neki insekti se hrane lišćem (cijela lisna ploča ili skeletizira list), drugi se hrane stabljikom (uključujući grizući stabljiku iznutra), jajnicima cvijeta, plodovima i korijenjem. Lisne uši i cikade sišu sok iz provodnih sudova uz pomoć proboscisa ili stajleta.

Unatoč mjerama koje se poduzimaju u borbi protiv insekata, problem smanjenja štete koju oni nanose i dalje je aktualno pitanje. Trenutno je više od 12% svjetskih poljoprivrednih usjeva izgubljeno kao rezultat napada patogenih mikroorganizama,

nematode i insekti.

Oštećenje ćelija dovodi do degradacije njihovog sadržaja, kao što su visokopolimerna jedinjenja, i pojave oligomernih signalnih molekula. Ovi "fragmenti olupine" [Tarchevsky, 1993] dopiru do susjednih stanica i induciraju zaštitnu reakciju u njima, uključujući promjene u ekspresiji gena i formiranje zaštitnih proteina koje oni kodiraju. Često su mehanička oštećenja biljaka popraćena njihovom infekcijom, jer se otvara površina rane kroz koju patogeni prodiru u biljku. Osim toga, fitopatogeni mikroorganizmi mogu živjeti u oralnim organima insekata. Poznato je, na primjer, da su prenosioci infekcije mikoplazmama cikade, kod kojih se odrasli oblici i ličinke hrane sokom prosijanih posuda biljaka, probijajući lisne poklopce stajletnim proboscisom i

Rice. 2. Šema interakcije ćelije patogena sa biljkom domaćinom / - kutinaza; 2 - produkti razgradnje komponenti kutikule (eventualno

ima signalna svojstva); 3 - (3-glukanaza i druge glikozilaze koje izlučuje patogen; 4 - elicitori - fragmenti ćelijskog zida domaćina (CS); 5 - hitinaze i druge glikozilaze koje destruktivno djeluju na patogena CS; 6 - elicitori - fragmenti patogena CS; 7 - fitoaleksini - inhibitori proteinaza, kutinaza, glikozilaza i drugih enzima patogena; 8 - toksične supstance patogena; 9 - jačanje CS domaćina zbog aktivacije peroksidaza i povećane sinteze lignina, taloženje hidroksiprolina proteini i lektini; 10 - induktori preosjetljivosti i nekroze susjednih stanica; // - produkti razgradnje kutina koji djeluju na stanicu patogena

mlade stabljike. Ružina čička, za razliku od drugih predstavnika šikare, isisava sadržaj ćelija. Cikade nanose manje štete biljnim tkivima od insekata koji jedu listove, međutim, biljke mogu reagirati na nju na isti način kao i na infekciju biljaka povezanih s njima.

U kontaktu sa biljkama, ćelije patogena luče različita jedinjenja koja obezbeđuju njihov prodor u biljku, ishranu i razvoj (slika 2). Neki od ovih spojeva su toksini koje patogeni luče kako bi oslabili otpor domaćina. Do sada je opisano više od 20 toksina specifičnih za domaćina koje proizvode patogene gljive.

Rice. 3. Fitotoksično jedinjenje iz Cochlio-bolus carbonum

Bakterije i gljive također stvaraju neselektivne toksine, posebno fusicoccin, erihoseten, coronatin, faz-olotoksin, syringomycin, tabtoxin.

Oslobađa se jedan od toksina specifičnih za domaćina

Pyrenophora triticirepentis je protein od 13,2 kDa, drugi su proizvodi sekundarnog metabolizma sa širokim spektrom struktura - to su poliketidi, terpenoidi, saharidi, ciklički peptidi itd.

U potonje u pravilu spadaju peptidi čija se sinteza odvija izvan ribozoma i koji sadrže ostatke D-aminokiselina. Na primjer, toksin specifičan za domaćina iz Cochliobolus carbonum ima strukturu tetrapeptidnog prstena (D-npo-L-ana-D-ana-L-A3JJ), gdje je posljednja skraćenica 2-amino-9,10-epoksi-8 -okso-de-kanoična kiselina (slika 3). Toksin se proizvodi u ćelijama patogena pomoću sintaze toksina. Otpornost na ovo jedinjenje u kukuruzu zavisi od gena koji kodira NADPH zavisnu karbonil reduktazu, koja smanjuje karbonilnu grupu, što rezultira

deaktivacija toksina. Pokazalo se da u tijelu biljke domaćina toksin izaziva inhibiciju histon deacetilaze i, kao posljedicu, hiperacetilaciju histona. Ovo potiskuje odbrambeni odgovor biljke na infekciju patogenom.

Druga vrsta spojeva koje luče patogeni nazivaju se elicitori (od engleskog elicit - identificirati, uzrokovati). Zbirni izraz "elicitor" je prvi put predložen 1972. godine za označavanje hemijskih signala koji se pojavljuju na mjestima infekcije biljaka patogenim mikroorganizmima i koji je postao široko rasprostranjen.

Elicitori igraju ulogu primarnih signala i pokreću složenu mrežu procesa indukcije i regulacije fitoimuniteta. To se manifestuje u sintezi zaštitnih proteina, neisparljivih biljnih antibiotika - fitoaleksina, u izolaciji antipatogenih isparljivih jedinjenja, itd. Trenutno je okarakterisana struktura mnogih prirodnih elicitora. Neke od njih proizvode mikroorganizmi, druge (sekundarni elicitori) nastaju enzimskim cijepanjem visokopolimernih spojeva kutikule i polisaharida staničnih zidova biljaka i mikroorganizama, a treći su fitohormoni stresa čija se sinteza u biljkama induciran je patogenima i abiogenim stresorima. Među najvažnijim elicitorima su proteinska jedinjenja koja izlučuju patogene bakterije i gljive, kao i proteini omotača virusa. Mali (10 kDa), konzervativni, hidrofilni, cisteinom obogaćeni elicitini koje luče sve proučavane vrste mogu se smatrati najviše proučavanim proteinskim elicitorima.

Phytophthora i Pythium. To uključuje, na primjer, kriptogein.

Elicitini izazivaju preosjetljivost i odumiranje zaraženih stanica, posebno kod biljaka iz roda Nicotiana. Najintenzivnije stvaranje elicitina od strane fitoftore događa se tokom rasta mi-

Utvrđeno je da su elicitini sposobni za transport sterola kroz membrane, budući da imaju mjesto vezanja sterola. Mnoge patogene gljive nisu u stanju da same sintetiziraju sterole, što objašnjava ulogu elicitina ne samo u ishrani mikroorganizama, već i u izazivanju obrambenog odgovora biljaka. Iz Phytophthora je izolovan glikoproteinski elicitor od 42 kDa. Njegovu aktivnost i vezivanje za proteinski receptor plazma membrane, čiji je monomerni oblik protein od 100 kDa, osiguran je oligopeptidnim fragmentom od 13 aminokiselinskih ostataka. Iz fitopatogene gljive Cladosporium fulvum dobijen je rasno-specifičan elicitor peptid koji se sastoji od 28 aminokiselinskih ostataka sa tri disulfidne grupe, a peptid je formiran od prekursora koji sadrži 63 aminokiseline. Ovaj faktor avirulencije pokazao je strukturnu homologiju sa nizom malih peptida, kao što su inhibitori karboksipeptidaze i blokatori jonskih kanala, i vezan za protein receptora plazma membrane, očigledno uzrokujući njegovu modulaciju, dimerizaciju i prenos signalnog impulsa na signalne sisteme. Veći predprotein Cladosporium fulvum od 135 aminokiselina se post-translaciono procesira u elicitor protein od 106 aminokiselina. Elicitorni proteini koje proizvodi gljiva rđe Uromyces vignae su dva mala polipeptida od 5,6 i 5,8 kDa, za razliku od drugih elicitina u svojstvima. Među bakterijskim proteinskim elicitorima, harpini su najviše proučavani.

Mnoge fitopatogene bakterije proizvode elicitor oligopeptide (njihov sintetički

sianski analozi), koji odgovaraju najkonzervativnijim regijama proteina - flagelin,

što je važan faktor u virulenciji ovih bakterija. Iz Erwinia amylovora izolovan je novi protein elicitor, čija je C-regija homologna enzimu pektat liaze, što može uzrokovati pojavu oligomernih fragmenata elicitora - produkata razgradnje pektina. Patogena bakterija Erwinia carotovora izlučuje elicitor protein harpin i enzime pektat liazu, celulazu, poligalakturonazu i proteaze koji hidroliziraju polimerne komponente staničnih zidova biljke domaćina (vidi sliku 2), što rezultira stvaranjem oligomernih molekula. Zanimljivo je da pektatna liaza koju luči Erwinia chrysanthemi,

stečena aktivnost kao rezultat ekstracelularne obrade. Neki lipidi i njihovi derivati su također

elicitori, posebno polinezasićene masne kiseline s 20 ugljika nekih patogena - arahidonske i eikozapentaenske [Ilyinskaya et al., 1991; Ozeretskovskaya et al., 1993; Ozeretskovskaya, 1994; Gilyazetdinov et al., 1995; Ilyinskaya et al., 1996a, b; Ilyinskaya, Ozeretskovskaya, 1998] i njihovi oksigenirani derivati. Pregledni rad [Ilyinskaya et al., 1991] sažima podatke o elicitorskom efektu lipida (lipoproteina) koje proizvode patogene gljive na biljke. Ispostavilo se da izazivajuće djelovanje nije proteinski dio lipoproteina, već njihov lipidni dio, a to su arahidonska (eikozatetraenska) i eikozapentaenska kiselina, koje nisu karakteristične za više biljke. Izazvali su stvaranje fitoaleksina, nekrozu tkiva i sistemsku rezistenciju biljaka na razne patogene. Proizvodi konverzije lipoksigenaze u biljnim tkivima C20 masnih kiselina (hidroperoksi-, hidroksi-, okso-, ciklički derivati, leukotrieni) nastaju u ćelijama biljke domaćina uz pomoć enzimskog kompleksa lipoksigenaze (čiji supstrati mogu biti i C,8 i C20 polienske masne kiseline) imale su snažan uticaj na odbrambeni odgovor biljaka. Ovo je očigledno zbog činjenice da nema kiseonika u nezaraženim biljkama.

derivata 20-ugljičnih masnih kiselina, a njihova pojava kao posljedica infekcije dovodi do dramatičnih rezultata, na primjer, do stvaranja nekroze oko inficiranih stanica, što stvara barijeru širenju patogena po biljci.

Postoje dokazi da je indukcija aktivnosti lipoksigenaze od strane patogena dovela do formiranja biljnog odgovora čak i u slučaju kada elicitor nije sadržavao C20 masne kiseline, a samo nativne C18 polienske masne kiseline mogle bi biti supstrat aktivnosti lipoksigenaze, a proizvodi bi mogli biti oktadekanoidi, a ne eikozanoidi. Syringolidi takođe imaju svojstva izazivanja [L et al., 1998] i cerebrozidi - sfingolipidna jedinjenja. Cerebrozidi A i C izolirani iz Magnaporthe grisea bili su najaktivniji elicitori za biljke riže. Proizvodi degradacije cerebrozida (metil estri masnih kiselina, sfingoidne baze, glikozil-sfingoidne baze) nisu pokazali elicitornu aktivnost.

Neki elicitori nastaju kao rezultat djelovanja na biljna tkiva hidrolaza koje oslobađaju patogeni. Svrha hidrolaze je dvostruka. S jedne strane obezbjeđuju ishranu patogenima neophodnu za njihov razvoj i reprodukciju, as druge strane popuštaju mehaničke barijere koje sprečavaju prodiranje patogena u njihova staništa u biljkama.

Jedna takva barijera je kutikula, koja se uglavnom sastoji od heteropolimera kutina ugrađenog u vosak. Otkriveno je više od 20 monomera koji čine kutin

To su zasićene i nezasićene masne kiseline i alkoholi različite dužine, uključujući hidroksilirane i epoksidirane, dugolančane dikarboksilne kiseline itd. U kutinu, većina primarnih alkoholnih grupa učestvuje u formiranju etarskih veza, kao i neke od sekundarnih alkoholnih grupa koje obezbeđuju poprečne veze između lanaca i tačaka grananja u polimeru. Dio drugog polimera "prepreke", suberina, po sastavu je blizak kutinu. Njegova glavna razlika je u tome što su slobodne masne kiseline glavna komponenta suberičnih voskova, dok ih je u kutinu vrlo malo. Osim toga, u pod

uglavnom su prisutni C22 i C24 masni alkoholi, dok kutin sadrži C26 i C28. Kako bi prevladale površinsku mehaničku barijeru biljaka, mnoge patogene gljive luče enzime koji hidroliziraju kutin i neke od komponenti suberina. Produkti reakcije kutinaze su različite oksigenirane masne kiseline i alkoholi, uglavnom 10,16-dihidroksi-CK- i 9,10,18-trihidroksi-C|8-kiseline, koje su signalni molekuli koji induciraju stvaranje i oslobađanje dodatnih količine kutinaze, koje "nagrizaju" kutin i olakšavaju prodiranje gljivice u biljku. Utvrđeno je da je period kašnjenja za pojavu mRNA kutinaze u gljivi nakon početka formiranja navedenih di- i trihidroksi kiselina bio samo 15 min, dok je oslobađanje dodatne kutinaze dvostruko duže. Oštećenje gena kutinaze kod Fusarium solani uvelike je smanjilo virulentnost ove gljive. Inhibicija kutinaze hemikalijama ili antitijelima spriječila je infekciju biljaka. Pretpostavka da oksigenirani proizvodi razgradnje kutina mogu djelovati ne samo kao induktori stvaranja kutinaze kod patogena, već i kao pokretači odbrambenih reakcija u biljci domaćinu [Tarchevsky, 1993], naknadno je potvrđena.

Nakon prodiranja patogenih mikroorganizama kroz kutikulu, neki od njih prelaze u vaskularne snopove biljaka i koriste tamo dostupne hranjive tvari za svoj razvoj, dok se drugi transportiraju u žive stanice domaćina. U svakom slučaju, patogeni nailaze na još jednu mehaničku barijeru - ćelijske zidove, koji se sastoje od različitih polisaharida i proteina i u većini slučajeva su ojačani krutim polimerom - ligninom [Tarchevsky, Marchenko, 1987; Tarčevski i Marčenko, 1991]. Kao što je već spomenuto, kako bi prevladali ovu barijeru i osigurali njihov razvoj ishranom ugljikohidratima i dušikom, patogeni luče enzime koji hidroliziraju polisaharide i proteine stanične stijenke.

Posebne studije su pokazale da tokom interakcije bakterija i tkiva biljke domaćina dolazi do enzima

degradacija se ne pojavljuje istovremeno. Na primjer, pektilmetilesteraza je također bila prisutna u neinokuliranoj Erwinia carotovora subsp. atroseptia u tkivima gomolja krompira, dok su se aktivnosti poligalakturonaze, pektat liaze, celulaze, proteaze i ksilanaze pokazale 10, 14, 16, 19, odnosno 22 sata nakon inokulacije.

Pokazalo se da produkti razgradnje oligosaharida polisaharida biljnih staničnih stijenki imaju elicitorna svojstva. Međutim, aktivne oligosaharide mogu formirati i polisaharidi koji su dio staničnih zidova patogena. Poznato je da je jedan od načina zaštite biljaka od patogenih mikroorganizama stvaranje nakon infekcije i oslobađanje van plazma membrane enzima - hitinaze i β-1,3-glukanaze, koji hidroliziraju hitin polisaharide i β-1,3-poliglukane. staničnih zidova patogena, što dovodi do inhibicije njihovog rasta i razvoja. Utvrđeno je da su oligosaharidni produkti takve hidrolize također aktivni pokretači odbrambenih reakcija biljaka. Kao rezultat djelovanja oligosaharida povećava se otpornost biljaka na bakterijske, gljivične ili virusne infekcije.

Oligosaharidni elicitori, njihova struktura, aktivnost, receptori, njihovo „uključivanje“ ćelijskih signalnih sistema, indukcija ekspresije odbrambenih gena, sinteza fitoaleksina, reakcije preosjetljivosti i drugi odgovori biljaka su predmet brojnih preglednih članaka.

U laboratoriji u Elbersheimu, a potom i u nizu drugih laboratorija, pokazalo se da oligoglikozidi nastali kao rezultat endoglikozidazne razgradnje hemiceluloza i pektinskih tvari biljaka, hitina i hitozana gljiva, mogu imati ulogu bioloških faktora. aktivne supstance. Čak je predloženo da se smatraju novom klasom hormona („oligosaharini“, za razliku od oligosaharida koji nemaju nikakvu aktivnost). Na primjeru je prikazano stvaranje oligosaharida kao rezultat hidrolize polisaharida, a ne u toku sinteze iz monosaharida.

AB11 i AB12 igraju ključnu ulogu u ABA-induciranoj

signalna staza kupatila. Uočena je aktivnost zavisna od pH i Mg2+.

ation ABU .

U protein fosfatazama MP2C, glavna meta je MAPKKK, koji se aktivira pod uticajem različitih stresora. Ova specifičnost postaje razumljiva, s obzirom da su neke proteinske fosfataze pronašle mjesta vezivanja sa svojim odgovarajućim protein kinazama.

Učesnici signala

ny sistem ćelija. Ovo omogućava da se obezbedi postojanje kompleksa protein kinaza-protein fosfataza i da se blokira transformacija i prenos signalnog impulsa u genom na pravovremen i efikasan način. Princip rada ovog mehanizma je prilično jednostavan: akumulacija određene protein kinaze, intermedijera signalnog lanca, aktivira fosfoprotein fosfatazu i dovodi do defosforilacije (inaktivacije) protein kinaze. Na primjer, aktivacija određenih protein kinaza može dovesti do fosforilacije i aktivacije odgovarajućih proteinskih fosfataza. U proučavanju funkcionisanja proteinskih fosfataza često se koriste specifični inhibitori, kao što su okadaična kiselina i kalikulin.

FAKTORI REGULACIJE TRANSKRIPCIJE

Sintezu glasničkih RNA kataliziraju DNK zavisne RNA polimeraze - jedan od najvećih proteinskih kompleksa, koji se sastoji od dvije velike i 5-13 malih podjedinica, što je određeno složenošću i značajem njihovih funkcija.Ove podjedinice imaju konzervativne aminokiseline sekvence, uglavnom ili u manjoj mjeri uobičajene za životinje i biljke, "aktivnost RNA polimeraze i prepoznavanje transkribiranih gena regulirano je nekoliko vrsta proteina. Faktori regulacije transkripcije privukli su najveću pažnju." Ovi proteini su u stanju da komuniciraju sa drugim proteinima, uključujući i identične, menjaju konformaciju fosforilacijom nekoliko svojih aminokiselina, [prepoznaju regulatorne nukleotidne sekvence u promotorskim regionima gena, što dovodi do promene intenziteta njihove ekspresije.: Faktori regulacije transkripcije usmjeravaju RNA-polimerazu do tačke inicijacije transkripcije odgovarajućeg gena (ili skupa gena), bez direktnog učešća u katalitičkom činu sinteze mRNA.

U životinjskim organizmima utvrđene su strukturne karakteristike više od 1000 faktora regulacije transkripcije. Kloniranje njihovih gena doprinijelo je dobijanju informacija koje su omogućile klasifikaciju ovih proteina.

Svi faktori regulacije transkripcije sadrže tri glavna domena. Domen koji se vezuje za DNK je najkonzervativniji. Aminokiselinska sekvenca u njemu određuje prepoznavanje određenih nukleotidnih sekvenci u promotorima gena.

U zavisnosti od homologije primarnih i sekundarnih struktura domena koji se vezuje za DNK, faktori regulacije transkripcije se dele u četiri superklase: 1) sa domenima obogaćenim bazičnim aminokiselinama; 2) sa DNK-vezujućim domenima koji koordiniraju jone cinka - "cinkovi prsti"; 3) sa heliks-turn-helix domenima; 4) sa domenima tipa |3-skele, koji formiraju kontakte sa malim žlebom DNK [Patrušev, 2000]. Svaka superklasa je podijeljena na klase, porodice i potporodice. U superklasi 1, vrijedni su pažnje regulatorni faktori transkripcije sa leucinskim zipper domenima, koji su ok-heliksa, u kojima je svaka sedma aminokiselina leucin koji strši sa jedne strane spirale. Hidrofobna interakcija leucinskih ostataka jednog molekula sa sličnom spiralom drugog molekula omogućava dimerizaciju (slično patent zatvaraču) faktora regulacije transkripcije neophodnih za interakciju sa DNK.

U superklasi 2, "cinkovi prsti" su aminokiselinske sekvence koje sadrže četiri cisteinska ostatka koji imaju koordinirajući učinak na jon cinka. "Cinkovi prsti" stupaju u interakciju s glavnim žlijebom DNK. U drugoj klasi ove superklase, strukturu "cinkovih prstiju" obezbjeđuju dva ostatka cisteina i dva ostatka histidina (slika 5), u drugoj klasi se vrši koordinacija dva jona cinka u jednom "prstu". sa šest cisteinskih ostataka. Vrhovi "cinkanih prstiju" su u kontaktu sa glavnim žlebom DNK.

Proučavanje strukture faktora regulacije transkripcije u biljkama omogućilo je uspostavljanje homologije sa proteinima ovog tipa, koji su karakteristični za životinjske objekte. Tipični faktori regulacije transkripcije sadrže sljedeća tri glavna strukturna elementa: DNK-vezivanje, oligomerizaciju i regulatorne domene. Monomerni oblici transkripcionih faktora su neaktivni, za razliku od dimernih (oligomernih) oblika. Formiranju oligomernih oblika prethodi fosforilacija monomernih oblika u citosolu, zatim se oni povezuju i potom dostavljaju u jezgro ili putem

Rice. 5. Struktura faktora regulacije transkripcije "cinkovog prsta".

G - ostatak histidina; C-S - cisteinski ostatak

specijalni transportni proteini ili zbog interakcije sa receptorskim proteinima u porama nuklearne membrane, nakon čega se prenose u jezgro i stupaju u interakciju sa promotorskim mestima

odgovarajućih gena. "Transkripcijski regulatorni faktori su kodirani od strane multigenskih porodica, a njihovu sintezu mogu inducirati patogeni i elicitori, a njihova aktivnost može biti promijenjena kao rezultat posttranslacijske modifikacije (uglavnom fosforilacija ili defosforilacija).

Sada je stvorena baza podataka koja se stalno širi o strukturi različitih faktora regulacije transkripcije i njihovih gena u biljkama. Pokazalo se da je specifičnost vezivanja DNK određena aminokiselinskim sekvencama zona jezgra i petlje u već spomenutim leucinskim patentnim zatvaračima, koji su jedna od najbrojnijih i najkonzervativnijih grupa faktora regulacije eukariotske transkripcije. Često se faktori regulacije transkripcije klasificiraju upravo prema strukturi domena koji se vezuju za DNK, što može uključivati spiralne sekvence aminokiselina, "cink prste" - područja sa dva cisteinska i dva histidinska ostatka ili sa mnogo ostataka cisteina, itd. U biljkama se jedan do četiri "cinkova prsta" nalaze u domenima faktora regulacije transkripcije koji se vezuju za DNK.

Mehanizam interakcije faktora regulacije transkripcije sa DNK zavisnim RNK polimerazama i promotorskim regionima gena ostaje jedan od ključnih i još uvek nedovoljno proučenih problema funkcionisanja ćelijskog genoma. Posebno su oskudne informacije o biljnim objektima.

Mutacije u genima koji kodiraju faktore regulacije transkripcije kod životinja mogu dovesti do određenih bolesti.

Predstavnici porodice gena koji kodiraju faktore regulacije transkripcije sa leucinskim patentnim zatvaračima opisani su u biljkama. Pokazalo se da su transkripcijski faktori ovog tipa odgovorni za formiranje zaštitnih antipatogenih proteina izazvano salicilatom i da mutacije ovih gena dovode do gubitka sposobnosti sinteze ovih proteina.

PROMOTORI GENA PROTEINA SIGNALNIH SISTEMA I ZAŠTITNIH PROTEINA

Trenutno se intenzivno proučava struktura promotorskih regija gena odgovornih za stjecanje imuniteta na različite patogene. Činjenica skoro istovremene sinteze većeg broja proteina izazvanih patogenom dugo je privlačila pažnju: to može biti uzrokovano kako divergencijom signalnih puteva u jednom signalnom sistemu, što uzrokuje aktivaciju nekoliko tipova faktora regulacije transkripcije, tako i „uključivanje“ nekoliko signalnih sistema od strane jednog ili drugog elicitora, koji, paralelno funkcionišući, aktiviraju nekoliko tipova faktora regulacije transkripcije i kao rezultat toga izazivaju ekspresiju nekoliko vrsta zaštitnih proteina. Moguće je i da promotori gena više pojedinačnih proteina imaju istu strukturu regulatornih elemenata, što dovodi do njihove simultane ekspresije čak i u slučaju aktivacije signala jednog predstavnika faktora regulacije transkripcije.1

Posljednja varijanta nastaje pod djelovanjem stresnog fitohormona etilena na biljke, kada faktor regulacije transkripcije stupi u interakciju s GCC kutijom promotorskih regija nekoliko etilenom inducibilnih gena, što omogućava manje-više istovremeno formiranje cijele grupe etilen- inducibilni proteini. Ovaj princip šaržne sinteze zaštitnih proteina se implementira kada ćelije reaguju na različite stresore ili elicitore (fitohormoni stresa se takođe mogu klasifikovati kao sekundarni elicitatori). Na primjer, pod djelovanjem povišenih temperatura indukuje se transkripcija grupe gena koja u promotorskim regijama sadrži zajedničku regulaciju.

element torusa HSE (element toplotnog šoka), koji je odsutan u drugim genima. Ovaj obrazac je potvrđen stvaranjem hibridnih gena sa promotorom gena toplotnog šoka koji je spojen sa drugim genom, koji obično ne menja intenzitet ekspresije pod dejstvom povišenih temperatura. U slučaju transgenih biljaka počelo je njegovo izražavanje. U eukariotskim ćelijama, regioni promotora sa sličnim nukleotidnim sekvencama su takođe pronađeni u različitim genima indukovanim istim intermedijerom (drugim glasnikom) signalnih sistema, na primer, cikličkim AMP. U posljednjem slučaju, nukleotidna signalna sekvenca promotorske regije označena je kao CRE (ciklični AMP element odgovora).

U Arabidopsisu je pronađen glukokortikoidni sistem za aktiviranje faktora regulacije transkripcije, čije je uključivanje dovelo do ekspresije zaštitnih gena izazvanih patogenom [N. Kang et al., 1999]. Uobičajene nukleotidne sekvence u G-kutiji su pro-

motori su bili CCACGTGG, au C-boxu - TGACGTCA.

Virus mozaika duhana i salicilna kiselina izazvali su u biljkama duhana indukciju dva gena faktora regulacije transkripcije klase WRKY, koji prepoznaju određenu nukleotidnu sekvencu, TTGAC (W-box), u promotorskim regijama zaštitnih gena. Aktivacija ovih faktora regulacije transkripcije izvršena je njihovom fosforilacijom protein kinazama. Svi proteini klase WRKY, za razliku od drugih klasa faktora transkripcije (kao što su bZIP i myb), imaju očuvani domen koji sadrži heptamerni pep-

tip WRKYGQK .

(Jedan od domena faktora regulacije transkripcije koji je odgovoran za konverziju jasmonatnog signala aktivira regulatornu regiju promotora nekoliko gena koji kodiraju proteine inducibilne jasmonat i elicitor, posebno striktozidin sintazu. Ispostavilo se da je N-terminal kiseli domen faktora regulacije transkripcije djeluje aktivirajuće, a C-terminalni domen -I obogaćen serinskim ostacima je inhibicijski.

Pokazalo se da promotor gena fenilalanin-amonijak-lijaze (najvažnijeg startnog enzima razgranatog metaboličkog procesa za sintezu jedinjenja koja imaju zaštitnu ulogu - salicilata, fenolne kiseline, fenilpropanoidnih fitoaleksina i lignina) sadrži dvije kopije. regiona obogaćenih AC ponavljanjima.

Proučavanjem promotora gena drugog sintejskog enzima fitoaleksina - halkon sintaze, u ćelijskoj kulturi pasulja, duvana i pirinča, ustanovljeno je da G-kutija (CACGTG) u području od -74 do -69 baznih parova i H-kutije (CSTACC) učestvuju u aktivaciji promotora. ) u regionu od -61 do -56 i od -126 do -121 bazni par.

U drugim eksperimentima je utvrđeno da, pod dejstvom elicitora, ekspresija gena halkon sintaze u biljkama graška zavisi od regiona promotora od -242 do -182 bp, u kojem dva regiona sadrže identične AT sekvence -TAAAATAST-, a jedan od njih, koji se nalazi u regionu od -242 do -226, bio je neophodan za ispoljavanje maksimalne aktivnosti gena.

Promotor gena za striktozidin sintazu, jedan od ključnih enzima induciranih elicitorima u sintezi terpenoidnih fitoaleksina, ima region aktiviran faktorima regulacije transkripcije od -339 do -145 bp. G-box, koji se nalazi blizu -105 bp, nije uticao na aktivnost promotera.

Proučavanjem aktivnosti |3-1,3-glukanaze gena u biljkama duhana, ustanovljeno je da on zavisi od promotorskog regiona od -250 do -217 baznih parova, koji sadrži sekvencu -GGCGGC-, karakterističnu za promotore geni koji kodiraju alkalne alkale izazvane patogenom

ny proteini.

Takozvana PR-kutija promotorskih regiona mnogih proteina izazvanih patogenom sadrži sekvencu (5'-AGCCGCC-3'), koja vezuje odgovarajuće faktore regulacije transkripcije, što dovodi do ekspresije gena ovih proteina, posebno endohitinaze i P-1,3-glukanaze u biljkama paradajza.

Mnogi geni proteina inducibilnih patogenom sadrže takozvane ocs-elemente u svojim promotorima, s kojima stupaju u interakciju faktori regulacije transkripcije koji imaju leucinske rajsferšluse u svojoj strukturi. U biljkama Arabidopsis, faktori regulacije transkripcije odgovorni za transdukciju etilenskog signala vezuju se i za GCC kutiju i za elemente promotora ocs, što rezultira ekspresijom niza odbrambenih proteina.

Istraživanje transgenih biljaka duhana sa promotorom alkalne hitinaze i reporterskim genom GUS otkrilo je da se promotorska regija aktivirana etilenskim signalom nalazi između -503 i -358 baznih parova, gdje se nalaze dvije kopije GCC kutije (5"-). TAAGAGCCGCC-3"), koji je karakteriziran -

ren za promotere mnogih proteina induciranih etilenom. Dalja analiza je pokazala da se mjesto promotora sa dvije kopije GCC kutije odgovorne za reakciju na etilen nalazi između -480 i -410 bp.

Proučavanjem odgovora biljaka duhana na tretman etilenom i infekciju virusom mozaika, ustanovljeno je da aktivnost promotora gena (3-1,3-glukanaze) ovisi o regiji koja se nalazi između -1452 i -1193 para baza, gdje se nalaze su dvije kopije heptanukleotida

5-AGCCGCC-3 ". Pronađen i dodan

filamentne regije bitne za regulaciju aktivnosti promotera.

Gore navedeni elicitori, receptori za elicitor, G-proteini, protein kinaze, protein fosfataze, faktori regulacije transkripcije, njihovi odgovarajući promotorski regioni gena uključeni su u funkcionisanje niza ćelijskih signalnih sistema, na kojima njihov odgovor na signale različite prirode a intenzitet zavisi: adenilat ciklaza, MAP-kinaza, fosfatidat, kalcijum, lipoksigenaza, NADPH oksidaza, NO sintaza i proton.

ADENILATNI CIKLAZNI SIGNALNI SISTEM

Ovaj signalni sistem je dobio ime po enzimu adenilat ciklazi, koji je prvi okarakterizirao Satherland, koji katalizuje formiranje glavnog signalnog intermedijera ovog sistema, cikličkog adenozin monofosfata (cAMP). Shema sistema adenilat ciklaze je sljedeća: vanjski kemijski signal, poput hormona ili elicitora, stupa u interakciju sa proteinskim receptorom plazma membrane, što dovodi do aktivacije G-proteina (vezujući GTP pomoću njega) i prijenos signalnog impulsa na enzim adenilat ciklazu (AC), koji katalizuje sintezu cAMP iz ATP-a (slika .6).

U sistemu adenilat ciklaze razlikuju se Gs proteini koji stimulišu adenilat ciklazu i (5, proteini koji inhibiraju aktivnost enzima).Razlike između ova dva tipa proteina su određene uglavnom karakteristikama oc-podjedinica, a ne (3- i y-podjedinice. Molekularne mase ocs - podjedinice G-proteina su 41-46 kDa, ag podjedinice - 40-41 kDa, (3, - i P2 podjedinice - 36-35 kDa, y-podjedinice - 8 -10 kDa Vezivanje GTP i njegova hidroliza za GDP i neorganski ortofosfat osiguravaju reverzibilnost procesa aktivacije adenilat ciklaze.

Adenilat ciklaza je monomerni integralni protein plazma membrane i stoga se teško ekstrahuje i pretvara u rastvorljiv oblik. Molekularna težina adenilat ciklaze u životinjskim ćelijama je 120-155 kDa; postoje i rastvorljivi oblici adenilat ciklaze 50-70 kDa, koji nisu osetljivi na kalmodulin i G-proteine. U biljkama, molekulska težina adenilat ciklaze je 84 kDa. Krivulja zavisnosti aktivnosti adenilat ciklaze od pH imala je unimodalni karakter, a vrhunac aktivnosti za ovaj enzim

menta je bio u pH opsegu od 4,8-5,2.

Podaci o izoformi adenilat ciklaze sa optimalnim

Imo pH jednak 8,8.

Adenilat ciklaza se može modificirati sa vanjske strane membrane glikozilacijom, a iznutra fosforilacijom pomoću A-kinaze [Severin, 1991.]. Aktivnost membranske adenilat ciklaze zavisi od fosfolipidne sredine - omjera fosfatidilholina, fosfatidiletanolamina, sfingomijelina, fosfatidila "eri-

on i fosfatidilinozitol.

Povećanje sadržaja cAMP u ćelijama izazvano elicitorima je prolazno, što se objašnjava aktivacijom PDE i, moguće, vezivanjem za cAMP zavisne protein kinaze. Zaista, povećanje koncentracije cAMP u stanicama aktivira različite cAMP zavisne protein kinaze, koje mogu fosforilirati različite proteine, uključujući faktore regulacije transkripcije, što dovodi do ekspresije različitih gena i odgovora stanice na vanjske utjecaje.

Faktor multiplikacije signala koji se postiže tokom njegovog prenosa u genom i ekspresije gena je više hiljada. Šema umnožavanja signala u funkcionisanju signalnog sistema adenilil ciklaze često se koristi u udžbenicima biohemije. Ovaj signalni sistem se nastavlja intenzivno proučavati na različitim objektima, dopunjavajući ideje o informacionom polju ćelija i njegovoj povezanosti sa spoljnim tokovima informacija.

Treba napomenuti da je pitanje funkcionisanja signalnog sistema adenilat ciklaze u biljnim objektima i dalje bilo diskutabilno gotovo četvrt stoljeća, dijeleći istraživače na njegove

GENSKA EKSPRESIJA

Rice. 6. Shema funkcionisanja signalizacije adenilat ciklaze

AC* sistemi - aktivni oblik adenilat ciklaze; PCA i PCA*- neaktivan-

naya i aktivni oblici protein kinaze A; PLplasmalemma; PDE - fosfodiesteraza; PGF* - aktivni oblik faktora regulacije transkripcije

pristalice [Doman, Fedenko, 1976; Koroljev i Vyskrebentseva, 1978; Franko, 1983; Javorskaja i Kalinjin, 1984; Newton and Brown 1986; Karimova, 1994, Assman, 1995; Trewavas, Malho, 1997; Trevavas, 1999; itd.] i protivnici. Prvi se oslanjao na podatke o povećanju aktivnosti adenilat ciklaze i sadržaja cAMP-a pod utjecajem fitohormona i patogena, na imitaciju djelovanja različitih fitohormona egzogenim cAMP-om, a drugi na činjenice koje ukazuju na nizak sadržaj cAMP-a. kod biljaka, na odsustvo u nizu eksperimenata uticaja fitohormona na aktivnost adenilat ciklaze i dr.

Napredak u oblasti molekularne genetike, poređenje strukture gena proteina koji učestvuju u signalnom sistemu adenilat ciklaze kod životinja i biljaka, nagnuo je vagu u korist pristalica njegovog funkcionisanja u biljkama. Rezultat-

Upotreba egzogenog cAMP-a [Kilev i Čekurov, 1977.] ili forskolina (aktivator adenilat ciklaze) ukazuje na uključenost cAMP-a u lanac transdukcije signala izazvanog signalom. Upotreba teofilina, inhibitora cAMP fosfodiesteraze, koji se pokazao prilično aktivnim u biljkama, pokazala je da se ulazni dio ravnoteže cAMP provodi prilično intenzivno [Yavorskaya, 1990; Karimova et al., 1990]. Dobijeni su podaci o promjenama sadržaja cAMP u biljkama pod utjecajem patogena, njegovoj potrebi za formiranje odgovora na djelovanje patogena [Zarubina i sar., 1979; Ocheretina et al., 1990].

Skreće se pažnja na činjenicu oslobađanja značajnog dijela cAMP-a koji se formira u stanicama životinja, prokariota, algi i viših rasa u vanćelijsku okolinu ovisno o ATP-u.

senke. By-

Značajno je da je kod biljaka, kao i kod životinja, bilo moguće smanjiti nakupljanje cAMP-a u ćelijama i njegovo oslobađanje u vanćelijsku sredinu uz pomoć prostaglandina, koji se ne nalazi u biljkama. Moguće

ali da tu ulogu obavlja oksilipin, sličan prostaglandinu, jasmonat. Mogućnost sudjelovanja u uklanjanju cAMP-a iz ćelije posebnog ATP-vezivanja

unos proteina.

Svrsishodnost sekrecije cAMP iz biljnih stanica u medij objašnjava se, prije svega, potrebom za dovoljno brzim smanjenjem koncentracije ovog drugog glasnika kako ne bi došlo do prekomjerne ekscitacije stanica. Relativno brzo smanjenje koncentracija sekundarnih glasnika nakon dostizanja maksimalnog nivoa neizostavna je nespecifična karakteristika funkcionisanja svih signalnih sistema.

Verovatno je da cAMP, koji se izlučuje van plazmaleme, učestvuje u regulaciji ekstracelularnih procesa [Shiyan, Lazareva, 1988]. Ovo gledište može biti zasnovano na otkriću protein kinaza zavisnih od ecto-cAMP koje koriste sekreciju cAMP iz ćelija da aktiviraju fosforilaciju proteina izvan plazmaleme. Takođe se veruje da cAMP izvan ćelije može delovati kao prvi glasnik [Fedorov i sar., 1990], izazivajući pokretanje kaskade reakcija signalnog sistema u susednim ćelijama, što je pokazano na primeru višećelijskih gljivica sluzi.

Skreću se pažnja na podatke dobijene kod životinja o inhibiciji egzogenim adenozinom (koji se može smatrati produktom degradacije cAMP) kalcijumskih kanala u ćelijama [Meyerson, 1986] i aktivaciji kalijumovih kanala [Orlov, Maksimova, 1999].

Od velikog su interesa podaci o mogućnosti regulacije razvoja patogenih gljivica izlučenim cAMP-om, posebno rđe ječma, Magnaporthe grisea, koja zahvaća biljke riže, rastresitog smuti Ustilago maydis, Erysiphe graminis, Colletotrichum trifolii, pigmentacije Ustilago hordei. U zavisnosti od koncentracije cAMP-a, razvoj gljivica je stimulisan ili potisnut. Vjeruje se da imaju heterotrimerne G proteine uključene u transdukciju cAMP signala.

Akumulira se sve više podataka o učinku različitih signalnih molekula na lučenje cAMP-a u biljnim stanicama. Pokazalo se da uloga ABA u adaptaciji biljaka na stres može biti u njenoj sposobnosti da reguliše sadržaj i oslobađanje cAMP iz ćelija. Pretpostavlja se da je smanjenje sadržaja cAMP pod dejstvom ABA uzrokovano ABA-indukovanim povećanjem sadržaja Ca2+ u citosolu i inhibicijom adenilat ciklaze. Poznato je da visoke koncentracije Ca2+ inhibiraju aktivnost adenilat ciklaze kod eukariota. Istovremeno, Ca2+ može smanjiti sadržaj cAMP, izazivajući povećanje aktivnosti fosfodiesteraze, koja hidrolizira cAMP. Zaista, aktivacija cAMP fosfodiesteraze kompleksom Ca2+-kalmodulina pronađena je u biljnim objektima [Fedenko, 1983].

Prikazana je zavisnost profila fosforilacije polipeptida o egzogenom cAMP-u. Broj polipeptida čiju je fosforilaciju stimulirao cAMP bio je najveći pri mikromolarnoj koncentraciji cAMP-a. Skreće se pažnja na činjenicu snažnog cAMP-indukovanog povećanja fosforilacije 10 kDa polipeptida na niskim temperaturama (slika 7) [Karimova, Zhukov, 1991; Yagusheva, 2000]. Zanimljivo je da je polipeptid ove molekularne težine proteinski regulator cAMP fosfodiesteraze, koji se aktivira apscizinskom kiselinom i Ca2+ i smanjuje sadržaj cAMP-a zbog njegove hidrolize fosfodiesterazom.

Proučavanje aktivacije cAMP zavisnih protein kinaza i njihove fosforilacije različitih proteina jedno je od najvažnijih područja istraživanja signalnog sistema adenilat ciklaze. cAMP zavisne protein kinaze (PKA) su enzimi koji se aktiviraju pri interakciji sa cAMP i kataliziraju prijenos terminalnog ostatka fosforne kiseline sa ATP-a na hidroksilne grupe serinskih ili treoninskih ostataka proteina akceptora. Kovalentna modifikacija proteina, koja se provodi tokom fosforilacije, dovodi do promjene njihove konformacije i katalitičke aktivnosti, izazivajući udruživanje ili disocijaciju njihovih podjedinica itd.

Molekularna težina proteina, kDa

Rice. Slika 7. Uticaj cAMP na fosforilaciju proteina kod trodnevnih sadnica graška [Karimova i Žukov, 1991.]

1 - kontrola: odrezani izdanci su prebačeni 2 sata sa peteljkama u vodu, zatim još 2 sata - u rastvor ortofosfata označen sa 32 R; 2 - rezane biljke su prebačene 2 h u rastvor 1 μM cAMP, a zatim još 2 h u rastvor 32 P označenog ortofosfata

Supstrati u reakciji protein kinaze su MgATP i fosforilirani protein. Proteinski supstrati mogu istovremeno biti supstrati za cGMP- i cAMP-zavisne protein kinaze za iste serinske (treoninske) ostatke, ali je stopa cAMP-ovisne fosforilacije 10-15 puta veća od one kod cGMP-ovisnih protein kinaza. Supstrati cAMP zavisnih protein kinaza nalaze se u svim dijelovima ćelije: citosol, endoplazmatski retikulum (EPR), Golgijev aparat, sekretorne granule, citoskelet i jezgro.

Protein kinaze aktivirane egzogenim cAMP izolovane su iz biljnih ćelija, na primjer, iz koleoptila kukuruza, protein kinaze od 36 kDa. Kato et al. izolovao tri tipa protein kinaza iz patke Lemna paucicostata: 165, 85 i 145 kDa, od kojih je jedna bila inhibirana cAMP, druga je aktivirana cAMP, a treća je bila cAMP nezavisna.

Drugi tip protein kinaza fosforilira polipeptide

59, 19, 16 i 14 kDa.

Egzogeni cAMP je izazvao promjene (uglavnom inhibiciju) u fosforilaciji brojnih polipeptida hloroplasta posredovane učešćem protein kinaza

Jedan od prvih gena protein kinaze kloniranih u biljkama bio je sličan familiji životinjskih protein kinaza A u nukleotidnim sekvencama. Postoje primjeri sličnosti sekvenci aminokiselina između biljnih protein kinaza A (njihova homologija) i životinjskih protein kinaza A. Nekoliko istraživačkih grupa prijavilo je kloniranje gena homolognih genu protein kinaze A (recenzije: ). Protein kinaza iz petunije fosforilira specifičan sintetički supstrat za protein kinazu A. Prijavljeno je da dodatak cAMP biljnim ekstraktima stimuliše fosforilaciju specifičnih proteina. Proučavanje mjesta fosforilacije u fenilalanin amonijak liazi (PAL), ključnom enzimu u biosintezi fitoaleksina, otkrilo je mjesta specifična za protein kinazu A.

Upotreba visoko specifičnog proteinskog inhibitora (BI) cAMP zavisnih protein kinaza omogućila je da se potvrdi pretpostavka da cAMP zavisne protein kinaze mogu biti aktivirane endogenim cAMP čak i tokom pripreme uzorka: BI je potisnuo bazalnu aktivnost protein kinaze ekstrakata iz listova u različitim eksperimentima za 30-50% [Karimova, 1994]. Intermedijeri signalnog sistema lipoksigenaze HDA i MeFA aktivirali su aktivnost protein kinaze za 33–8% u prisustvu cAMP [Karimova et al., 19996]. Salicilna kiselina je izazvala povećanje nivoa cAMP zavisne fosforilacije 74, 61 i 22 kDa polipeptida u listovima graška [Mukhametchina, 2000]. cAMP-stimulirana aktivnost protein kinaze rastvorljivih proteina lista graška zavisila je od koncentracije Ca2+ [Karimova et al., 1989; Tarčevskaja, 1990; Karimova, Žukov, 1991], a enzimska aktivnost je takođe pronađena u izolovanim ćelijskim zidovima, jezgrima i plazma membranama.

U biljkama su pronađeni geni koji kodiraju enzim protein fosfatazu, čija su meta proteini fosforilirani protein kinazom A.

Za karakterizaciju signalnog sistema adenilil ciklaze, izuzetno je važno pronaći u biljkama gene koji kodiraju faktore regulacije transkripcije proteina koji imaju duge nukleotidne sekvence homologne CREBS-u, transkripcionom faktoru koji se vezuje za cAMP kod životinja.

Brojni podaci o djelovanju cAMP-a na jonske kanale biljnih stanica i relativno slaba eksperimentalna baza ideja o mogućnosti signalizacije cAMP-a kroz fosforilaciju proteinskih faktora koji reguliraju transkripciju u genom, s jedne strane, jačaju pozicije pristalica. postojanja indirektnog (kroz aktivaciju jonskih kanala) signalnog puta adenilat ciklaze i, s druge strane, tjeraju nas na intenziviranje pokušaja dobivanja dokaza o funkcionisanju direktnog cAMP signalnog puta.

MAP-KINAZA SIGNALNI SISTEM

Proteinske kinaze tipa serin-treonin (MAPK) aktivirane mitogenom i signalna kaskada MAP-kinaze (signal -> receptor -> G-proteini -> MAPKKK -»

-> MARCK -> MAPK -> PGF -> genom), koji su dovoljno proučavani na životinjskim objektima, funkcionišu i u biljnim ćelijama (slika 8). Njima su posvećeni pregledni članci.

I djela eksperimentalne prirode, koja daju informacije o pojedinim predstavnicima ovog signalnog sistema i posebno

karakteristike njihove regulacije.

Kaskada MAP kinaze se „uključuje“ tokom mitoze (što objašnjava naziv ovih protein kinaza), tokom dehidracije

nii, hipoosmo-

tik stres, niske temperature, mehanička iritacija biljaka

Oštećenje tkiva, oksidativni stres, djelovanje patogena, elicitori (in

uključujući harpine, kriptogain, oligosaharide), fitohormone stresa jasmonat, sali-

cilat, sistemin, etilen).

Ovisnost funkcionisanja kaskade MAP kinaze od različitih uticaja ogleda se u nazivima nekih MAP kinaza, na primer, WIPK i SIPK (odnosno,

protein kinaze izazvane venskom ranom i protein inducirani salicilatom

Rice. 8. Šema funkcionisanja signalnog sistema MAP-kinaze

KKMARK - MAP kinaza kinaza kinaza; KMARK - MAPkinaza kinaza; MAPK je protein kinaza aktivirana mitogenom. Ostale oznake - vidi sl. 6

Otpornost biljaka na patogene određena je, kako je ustanovio H. Flor 1950-ih, interakcijom komplementarnog para gena biljke domaćina i patogena, odnosno gena otpornosti (R) i gena avirulencije (Avr). Specifičnost njihove interakcije sugerira da su produkti ekspresije ovih gena uključeni u biljno prepoznavanje patogena uz naknadnu aktivaciju signalnih procesa za pokretanje odbrambenih odgovora.

Trenutno je poznato 7 signalnih sistema: cikloadenilat, MAP-kinaza (protein-kinaza aktivirana mitogenom), fosfatidna kiselina, kalcijum, lipoksigenaza, NADP H-oksidaza (superoksid sintaza), NO-sintaza.

U prvih pet signalnih sistema, G proteini posreduju između citoplazmatskog dijela receptora i prvog aktiviranog enzima. Ovi proteini su lokalizovani na unutrašnjoj strani plazmaleme. Njihovi molekuli se sastoje od tri podjedinice: a, b i g.

Ciklodenilat signalni sistem. Interakcija stresora sa receptorom na plazma membrani dovodi do aktivacije adenilat ciklaze, koja katalizuje stvaranje cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) iz ATP-a. cAMP aktivira jonske kanale, uključujući kalcijum signalni sistem, i cAMP zavisne proteinske kinaze. Ovi enzimi aktiviraju proteine koji regulišu ekspresiju odbrambenih gena fosforilacijom.

Sistem signalizacije MAP kinaze. Aktivnost protein kinaza je povećana kod biljaka izloženih stresu (plavo svjetlo, hladnoća, sušenje, mehanička oštećenja, stres soli), kao i tretirane etilenom, salicilnom kiselinom ili zaražene patogenom.

U biljkama, kaskada protein kinaze funkcionira kao put za prijenos signala. Vezivanje elicitora za receptor plazma membrane aktivira MAP kinaze. On katalizuje fosforilaciju citoplazmatske kinaze MAP kinaze, koja aktivira MAP kinazu nakon dvostruke fosforilacije ostataka treonina i tirozina. Prolazi u jezgro, gdje fosforilira transkripcione regulatorne proteine.

Signalni sistem fosfatido kiseline. U životinjskim ćelijama, G proteini pod uticajem stresora aktiviraju fosfolipaze C i D. Fosfolipaza C hidrolizuje fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat u dijacilglicerol i inozitol-1,4,5-trifosfat. Potonji oslobađa Ca2+ iz vezanog stanja. Povećan sadržaj jona kalcija dovodi do aktivacije Ca2+ zavisnih protein kinaza. Diacilglicerol se nakon fosforilacije specifičnom kinazom pretvara u fosfatidnu kiselinu, koja je signalna tvar u životinjskim stanicama. Fosfolipaza D direktno katalizira stvaranje fosfatidne kiseline iz membranskih lipida (fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin).

U biljkama, stresori aktiviraju G proteine, fosfolipaze C i D u biljkama. Stoga su početne faze ovog signalnog puta iste u životinjskim i biljnim stanicama. Može se pretpostaviti da se u biljkama formira i fosfatidna kiselina koja može aktivirati protein kinaze uz naknadnu fosforilaciju proteina, uključujući faktore regulacije transkripcije.

signalni sistem kalcijuma. Izloženost različitim faktorima (crveno svjetlo, salinitet, suša, hladnoća, toplotni šok, osmotski stres, apscizinska kiselina, giberelin i patogeni) dovodi do povećanja sadržaja kalcijevih jona u citoplazmi zbog povećanja uvoza iz vanjskog okruženja. i izvan intracelularnog skladištenja (endoplazmatski retikulum i vakuole)

Povećanje koncentracije jona kalcija u citoplazmi dovodi do aktivacije rastvorljivih i membranski vezanih Ca2+-zavisnih protein kinaza. Oni su uključeni u fosforilaciju proteinskih faktora koji regulišu ekspresiju zaštitnih gena. Međutim, pokazalo se da Ca2+ može direktno utjecati na ljudski transkripcijski represor bez pokretanja kaskade fosforilacije proteina. Kalcijumovi joni takođe aktiviraju fosfataze i fosfoinozit-specifičnu fosfolipazu C. Regulatorni efekat kalcijuma zavisi od njegove interakcije sa intracelularnim receptorom kalcijuma, proteinom kalmodulina.

Signalni sistem lipoksigenaze. Interakcija elicitora sa receptorom na plazma membrani dovodi do aktivacije membranski vezane fosfolipaze A2, koja katalizuje oslobađanje nezasićenih masnih kiselina, uključujući linolnu i linolensku kiselinu, iz fosfolipida plazma membrane. Ove kiseline su supstrati za lipoksigenazu. Supstrati za ovaj enzim mogu biti ne samo slobodne, već i nezasićene masne kiseline koje su dio triglicerida. Aktivnost lipoksigenaza se povećava pod dejstvom elicitora, infekcije biljaka virusima i gljivama. Povećanje aktivnosti lipoksigenaza je posljedica stimulacije ekspresije gena koji kodiraju ove enzime.

Lipoksigenaze kataliziraju dodavanje molekularnog kisika jednom od atoma ugljika (9 ili 13) cis,cis-pentadienskog radikala masnih kiselina. Intermedijarni i krajnji produkti metabolizma masnih kiselina lipoksigenaze imaju baktericidna, fungicidna svojstva i mogu aktivirati protein kinaze. Tako su hlapljivi proizvodi (heksenali i nonenali) toksični za mikroorganizme i gljive, 12-hidroksi-9Z-dodecenska kiselina stimulira fosforilaciju proteina u biljkama graška, fitodienska, jasmonska kiselina i metil jasmonat povećavaju nivo ekspresije zaštitnih gena kroz aktivaciju protein kinaze .

NADP·N-oksidazni signalni sistem. U mnogim slučajevima, infekcija patogenima je stimulirala proizvodnju reaktivnih vrsta kisika i smrt stanica. Reaktivne vrste kiseonika nisu samo toksične za patogene i inficirane ćelije biljke domaćina, već su i učesnici u signalnom sistemu. Dakle, vodikov peroksid aktivira faktore regulacije transkripcije i ekspresiju zaštitnih gena.

NO sintaza signalni sistem. U makrofagima životinja koji ubijaju bakterije, zajedno s reaktivnim kisikovim vrstama, djeluje dušikov oksid koji pojačava njihovo antimikrobno djelovanje. U životinjskim tkivima, L-arginin se pretvara u NO sintazu u citrulin i NO. Aktivnost ovog enzima utvrđena je i u biljkama, a virus mozaika duhana je inducirao povećanje njegove aktivnosti kod rezistentnih biljaka, ali nije utjecao na aktivnost NO sintaze u osjetljivim biljkama. NO, u interakciji sa kisikovim superoksidom, stvara vrlo toksičan peroksinitril. S povećanom koncentracijom dušikovog oksida aktivira se gvanilat ciklaza, koja katalizira sintezu cikličkog gvanozin monofosfata. Aktivira protein kinaze direktno ili kroz stvaranje cikličke ADP-riboze, koja otvara Ca2+ kanale i time povećava koncentraciju jona kalcija u citoplazmi, što zauzvrat dovodi do aktivacije Ca2+ zavisnih protein kinaza.

Dakle, u biljnim ćelijama postoji koordiniran sistem signalnih puteva koji mogu delovati nezavisno jedan od drugog ili zajedno. Karakteristika signalnog sistema je pojačanje signala u procesu njegovog prenosa. Uključivanje signalnog sistema kao odgovor na uticaj različitih stresora (uključujući i patogene) dovodi do aktivacije ekspresije zaštitnih gena i povećanja otpornosti biljaka.

Inducirani mehanizmi: a) pojačano disanje, b) nakupljanje supstanci koje obezbeđuju stabilnost, c) stvaranje dodatnih zaštitnih mehaničkih barijera, d) razvoj reakcije preosetljivosti.

Uzročnik, koji je savladao površinske barijere i ušao u provodni sistem i biljne ćelije, izaziva bolest biljke. Priroda bolesti ovisi o otpornosti biljke. Prema stepenu otpornosti razlikuju se četiri kategorije biljaka: osjetljive, tolerantne, preosjetljive i izrazito otporne (imune). Ukratko ih okarakterizirajmo na primjeru interakcije biljaka s virusima.

U osjetljivim biljkama virus se prenosi iz inicijalno zaraženih stanica kroz cijelu biljku, dobro se razmnožava i uzrokuje razne simptome bolesti. Međutim, kod osjetljivih biljaka postoje zaštitni mehanizmi koji ograničavaju virusnu infekciju. O tome svjedoči, na primjer, nastavak reprodukcije virusa mozaika duhana u protoplastima izoliranim iz zaraženih listova biljaka duhana, u kojima je rast infektivnosti završen. Tamnozelene zone koje se formiraju na mladim listovima oboljelih osjetljivih biljaka odlikuju se visokim stupnjem otpornosti na viruse. Ćelije ovih zona ne sadrže gotovo nikakve virusne čestice u poređenju sa susjednim ćelijama svijetlozelenog tkiva. Nizak nivo akumulacije virusa u tamnozelenim ćelijama tkiva povezan je sa sintezom antivirusnih supstanci. U tolerantnim biljkama virus se širi po cijeloj biljci, ali se ne razmnožava dobro i ne uzrokuje simptome. U preosjetljivim biljkama, prvobitno zaražene i susjedne stanice postaju nekrotične, lokalizirajući virus u nekrozi. Vjeruje se da se kod ekstremno otpornih biljaka virus razmnožava samo u prvobitno zaraženim stanicama, ne prenosi se kroz biljku i ne uzrokuje simptome bolesti. Međutim, prikazan je transport virusnog antigena i subgenomske RNK u ovim biljkama, a kada su zaražene biljke držane na niskoj temperaturi (10-15°C), na zaraženim listovima se formirala nekroza.

Najviše su proučavani mehanizmi otpornosti preosjetljivih biljaka. Formiranje lokalne nekroze tipičan je simptom preosjetljive reakcije biljaka kao odgovor na napad patogena. Nastaju kao rezultat smrti grupe stanica na mjestu unošenja patogena. Smrt inficiranih ćelija i stvaranje zaštitne barijere oko nekroze blokiraju transport infektivnog principa kroz biljku, sprečavaju pristup nutrijentima patogenu, izazivaju eliminaciju patogena, dovode do stvaranja antipatogenih enzima, metabolita i signalizacije. tvari koje aktiviraju zaštitne procese u susjednim i udaljenim stanicama i u konačnici doprinose oporavku biljke. Ćelijska smrt nastaje zbog uključivanja programa genetske smrti i stvaranja spojeva i slobodnih radikala koji su toksični i za patogen i za samu ćeliju.

Nekrotizacija inficiranih ćelija preosjetljivih biljaka, kontrolirana genima patogena i biljke domaćina, poseban je slučaj programirane ćelijske smrti (PCD). PCD je neophodan za normalan razvoj organizma. Tako se javlja, na primjer, tokom diferencijacije traheidnih elemenata tokom formiranja ksilemskih žila i odumiranja ćelija kapice korijena. Ove periferne ćelije umiru čak i kada korijenje raste u vodi, što znači da je smrt stanica dio razvoja biljke, a ne uzrokovana djelovanjem tla. Sličnost između PCD i smrti ćelije u preosetljivoj reakciji je u tome što su to dva aktivna procesa, u nekrotiziranoj ćeliji se povećava i sadržaj kalcijumovih jona u citoplazmi, formiraju se membranski vezikuli, povećava se aktivnost deoksiribonukleaza, DNK se raspada na fragmente sa 3'OH završava, dolazi do kondenzacije jezgra i citoplazme.

Osim uključivanja PCD-a, dolazi do nekrotizacije inficiranih stanica preosjetljivih biljaka kao rezultat oslobađanja fenola iz centralne vakuole i hidrolitičkih enzima iz lizosoma zbog narušavanja integriteta staničnih membrana i povećanja njihove permeabilnosti. Smanjenje integriteta ćelijskih membrana je posljedica peroksidacije lipida. Može se javiti uz učešće enzima i na neenzimski način kao rezultat delovanja reaktivnih vrsta kiseonika i slobodnih organskih radikala.

Jedno od karakterističnih svojstava preosjetljivih biljaka je stečena (inducirana) otpornost na ponovnu infekciju patogenom. Predloženi su termini sistemska stečena rezistencija (SAR) i lokalizovana stečena rezistencija (LAR). Za LAR se kaže da postoji u slučajevima kada ćelije steknu otpor u području neposredno uz lokalnu nekrozu (udaljenost od približno 2 mm). U ovom slučaju sekundarna nekroza uopće ne nastaje. Stečena rezistencija se smatra sistemskom ako se razvije u bolesnim biljnim stanicama udaljenim od mjesta inicijalnog unošenja patogena. SAR se manifestuje u smanjenju nivoa akumulacije virusa u ćelijama, smanjenju veličine sekundarne nekroze, što ukazuje na inhibiciju kratkog transporta virusa. Nije jasno da li se LAR i SAR razlikuju jedan od drugog ili je to isti proces koji se odvija u ćelijama koje se nalaze na različitim udaljenostima od mjesta početnog ulaska virusa u biljku.

Stečena rezistencija je obično nespecifična. Otpornost biljaka na viruse uzrokovana je bakterijskim i gljivičnim infekcijama i obrnuto. Otpornost mogu izazvati ne samo patogeni, već i razne supstance.

Razvoj SAR-a povezan je sa širenjem tvari koje se formiraju u prvobitno zaraženim listovima po cijeloj biljci. Pretpostavlja se da je induktor SAR salicilna kiselina, koja nastaje tokom nekroze inicijalno inficiranih ćelija.

Kada se bolest pojavi, u biljkama se nakupljaju tvari koje povećavaju njihovu otpornost na patogene. Važnu ulogu u nespecifičnoj rezistenciji biljaka imaju antibiotske supstance - isparljive, koje je otkrio B. Tokin 20-ih godina 20. veka. Tu spadaju niskomolekularne supstance različite strukture (alifatska jedinjenja, kinoni, glikozidi sa fenolima, alkoholi) koje mogu usporiti razvoj ili ubiti mikroorganizme. Oslobađajući se kada su luk i češnjak ozlijeđeni, hlapljivi fitoncidi štite biljku od patogena već iznad površine organa. Nehlapljivi fitoncidi su lokalizirani u integumentarnim tkivima i uključeni su u stvaranje zaštitnih svojstava površine. Unutar ćelija mogu se akumulirati u vakuolama. U slučaju oštećenja, količina fitoncida se naglo povećava, što sprečava moguću infekciju ranjenih tkiva.

Fenoli se takođe klasifikuju kao antibiotska jedinjenja u biljkama. U slučaju oštećenja i bolesti u stanicama se aktivira polifenol oksidaza koja oksidira fenole u visoko toksične kinone. Fenolni spojevi ubijaju patogene i biljne stanice domaćina, inaktiviraju egzoenzime patogena i potrebni su za sintezu lignina.

Među virusnim inhibitorima pronađeni su proteini, glikoproteini, polisaharidi, RNK, fenolna jedinjenja. Postoje inhibitori infekcije koji direktno utiču na virusne čestice, čineći ih neinfektivnim, ili blokiraju receptore virusa. Na primjer, inhibitori iz soka cvekle, peršina i ribizle izazvali su gotovo potpuno uništavanje čestica virusa mozaika duhana, dok je sok aloe uzrokovao linearnu agregaciju čestica, što je smanjilo mogućnost prodiranja čestica u ćelije. Inhibitori reprodukcije mijenjaju ćelijski metabolizam, čime povećavaju otpornost ćelije ili inhibiraju reprodukciju virusa. Proteini koji inaktiviraju ribosome (RIP) su uključeni u otpornost biljaka na viruse.

U ultraosjetljivim biljkama duhana zaraženim virusom mozaika duhana, pronađeni su proteini, izvorno nazvani b-proteini, a sada se nazivaju proteini povezani s patogenezom (PR-proteini) ili proteini povezani s otpornošću. Uobičajeni naziv "PR proteini" sugerira da njihovu sintezu induciraju samo patogeni. Međutim, ovi proteini se formiraju i kod zdravih biljaka tokom cvatnje i raznih stresova.

1999. godine, na osnovu sekvence aminokiselina, seroloških svojstava, enzima i biološke aktivnosti, stvorena je jedinstvena nomenklatura PR proteina za sve biljke, koja se sastoji od 14 porodica (PR-1 - PR-14). Neki PR proteini imaju aktivnosti proteaze, ribonukleaze, 1,3-b-glukanaze, hitinaze ili su inhibitori proteaze. Više biljke nemaju hitin. Vjerovatno su ovi proteini uključeni u odbranu biljaka od gljivica, budući da su hitin i b-1,3-glukani glavne komponente ćelijskih zidova mnogih gljiva, a hitinaza hidrolizira b-1,3 veze hitina. Hitinaza može djelovati i kao lizozim hidroliziranjem peptidoglukana bakterijskih ćelijskih zidova. Međutim, b-1,3-glukanaza može olakšati transport virusnih čestica preko lista. To je zbog činjenice da b-1,3-glukanaza uništava kalozu (b-1,3-glukan), koja se taloži u ćelijskom zidu i plazmodezmama i blokira transport virusa.

Sastav PR proteina uključuje i proteine niske molekularne težine (5 kDa) - modifikatore ćelijskih membrana gljiva i bakterija: tionine, defenzine i proteine za prijenos lipida. Tionini su toksični u in vitro uvjetima za fitopatogene gljive i bakterije. Njihova toksičnost je posljedica destruktivnog djelovanja na membrane patogena. Defenzini imaju jaka antifungalna svojstva, ali ne djeluju na bakterije. Defenzini iz biljaka iz porodica Brassicaceae i Saxifragaceae suzbijali su rast gljivičnih hifa rastezanjem, ali su podsticali njihovo grananje. Defenzini iz biljaka iz porodica Asteraceae, Fabaceae i Hippocastanaceae usporili su elongaciju hifa, ali nisu utjecali na njihovu morfologiju.

Kada su biljke zaražene patogenima, povećava se aktivnost litičkog odjeljka stanica osjetljivih i preosjetljivih biljaka. Litički odjeljak biljnih stanica uključuje male vakuole - derivate endoplazmatskog retikuluma i Golgijevog aparata, koji funkcioniraju kao primarni životinjski lizozomi, odnosno strukture koje sadrže hidrolaze koje nemaju supstrate za ove enzime. Pored ovih vakuola, litički kompartment biljnih ćelija uključuje centralnu vakuolu i druge vakuole ekvivalentne sekundarnim lizozomima životinjskih ćelija koje sadrže hidrolaze i njihove supstrate, kao i plazmalemu i njene derivate, uključujući paramuralna tela, i ekstracelularne hidrolaze lokalizovane u ćelijskom zidu iu prostoru između zida i plazmaleme.

Burachenko D.L. signalne strukture. Dio 3 (Dokument)

Savremene metode istraživanja ćelija (priručnik) (Dokument)

Signalne table T-4U2, T-6U2, T-8U2, T-10U2. Tehnički opis i uputstva za rad i popravku (Dokument)

CNS Anatomy Spur (Cheat Sheet)

Kozinets G.I. Atlas krvnih stanica i koštane srži (Dokument)

n1.doc

UDK 58 BBK 28.57 T22

Izvršni urednik dopisni član Ruske akademije nauka A.I. Grechkin

Recenzenti:

L.H. Gordon doktor bioloških nauka, prof L.P. Khokhlova

Tarchevsky I.A.

Signalni sistemi biljnih ćelija / I.A. Tarchevsky; [Resp. ed. A.N. Grechkin]. - M.: Nauka, 2002. - 294 str.: ilustr. ISBN 5-02-006411-4

Za specijaliste iz oblasti fiziologije biljaka, biohemičare, biofizičare, genetičare, fitopatologe, ekologe, agrobiologe.

Na mreži AK

Tarchevsky I.A.

Sistemi signalizacije biljnih ćelija /1.A. Tarchevsky; . - M.: Nauka, 2002. - 294 str.; il. ISBN 5-02-006411-4

Za fiziologe, biohemičare, biofizičare, genetičare, fitopatologe, ekologe i agrobiologe

ISBN 5-02-006411-4

(umjetnički dizajn), 2002

Članci eksperimentalne prirode uvršteni su u popis literature, što je u određenoj mjeri zavisilo od ograničenog obima knjige i vremena za njenu pripremu. Autor se izvinjava kolegama čije istraživanje nije odraženo u knjizi.

Ovaj rad su finansijski podržali Vodeća naučna škola Ruske Federacije (grantovi 96-15-97940 i 00-15-97904) i Ruska fondacija za osnovna istraživanja (grant 01-04-48-785).

UVOD

Po prvi put u našoj zemlji, E.S. Severin (Severin, Kochetkova, 1991) o životinjskim predmetima i O.N. Kulaeva [Kulaeva et al., 1989; Kulaeva, 1990; Kulaeva i dr., 1992; Kulaeva, 1995; Burkhanova et al., 1999] - o biljkama.

Najznačajnije nespecifične promjene u biotičkom stresu uključuju sljedeće:

Faza u razvoju u vremenu odgovora na djelovanje patogena.
Povećan katabolizam lipida i biopolimera.
Povećanje sadržaja slobodnih radikala u tkivima.
Zakiseljavanje citosola praćeno aktivacijom protonske pumpe, čime se pH vraća na prvobitnu vrijednost.
Povećanje sadržaja kalcijevih jona u citosolu sa
naknadna aktivacija kalcijum ATPaze.
Izlaz iz ćelija jona kalijuma i hlora.
Pad membranskog potencijala (na plazmalemi).
Smanjenje ukupnog intenziteta sinteze biopolimera i lipida.
Zaustavljanje sinteze nekih proteina.

Jačanje sinteze ili sinteze odsutnog tako
nazvani zaštitnim proteinima izazvanim patogenom (chi-
tinaze, (3-1,3-glukanaze, inhibitori proteinaze, itd.).
Intenziviranje sinteze jačanja stanica
zidovi komponenti - lignin, suberin, kutin, kaloza,
protein bogat hidroksiprolinom.
Sinteza antipatogenih nehlapljivih spojeva - fitoaleksina.
Sinteza i izolacija hlapljivih baktericidnih i fun-
hicidna jedinjenja (heksenali, nonenali, terpeni i

dr->-

Jačanje sinteze i povećanje sadržaja (ili prema
fenomen) fitohormona stresa - apscis, jasmo-
novo, salicilne kiseline, etilen, peptidni hormon
priroda sistema.
Inhibicija fotosinteze.
Preraspodjela ugljika iz | 4 CO 2, asimilovanog u
proces fotosinteze, među raznim jedinjenjima -
smanjenje uključivanja oznake u visokopolimerna jedinjenja (proteini, škrob) i saharozu i poboljšanje (češće
tijelo - kao postotak apsorbiranog ugljika) - u alanin,
malat, aspartat (Tarchevsky, 1964).

17. Pojačano disanje praćeno njegovom inhibicijom.
Aktivacija alternativne oksidaze koja mijenja smjer transporta elektrona u mitohondrijima.

18. Povrede ultrastrukture - promjena kazne
granularna struktura jezgra, smanjenje broja polisoma i
diktiosomi, oticanje mitohondrija i hloroplasta, smanjuju
smanjenje broja tilakoida u hloroplastima, preuređenje cito-
skelet.

Apoptoza (programirana smrt) ćelija
izloženi patogenima i uz njih.
Pojava sistemske nespecifične tzv
otpornost na patogene na udaljenim lokacijama
mjesta izloženosti patogenima (npr
organi) biljke.

Mnoge od gore navedenih promjena posljedica su „uključenja“ relativno malog broja nespecifičnih signalnih sistema od strane stresora.

Kako se mehanizmi odgovora biljaka na djelovanje patogena sve više proučavaju, otkrivaju se novi nespecifični odgovori biljnih stanica. To uključuje ranije nepoznate signalne puteve.

Ney hand. Nekoliko tipova strukture ovih receptora ujedinjeno je u biljnim i životinjskim ćelijama. Nekovalentna interakcija spoljašnjeg regiona receptora sa jednim ili drugim signalnim molekulom koji dolazi iz okoline koja okružuje ćeliju dovodi do promene konformacije receptorskog proteina, koja se prenosi u unutrašnji, citoplazmatski region. U većini signalnih sistema, posredni G-proteini su u kontaktu sa njim - još jedna objedinjena (u smislu svoje strukture i funkcija) karika signalnih sistema. G-proteini obavljaju funkciju pretvarača signala, prenoseći konformacioni impuls signala do startnog enzima specifičnog za određeni signalni sistem. Početni enzimi istog tipa signalnog sistema u različitim objektima su takođe univerzalni i imaju proširene regije sa istom sekvencom aminokiselina. Jedna od najvažnijih objedinjenih karika signalnih sistema su protein kinaze (enzimi koji prenose terminalni ostatak ortofosforne kiseline sa ATP-a na određene proteine), aktivirane produktima početnih signalnih reakcija ili njihovim derivatima. Fosforilirani proteini protein kinazama su sljedeće karike u signalnim lancima. Još jedna objedinjena karika u sistemima ćelijske signalizacije su faktori regulacije proteinske transkripcije, koji su jedan od supstrata reakcija protein kinaze. Struktura ovih proteina je takođe u velikoj meri unificirana, a strukturne modifikacije određuju da li faktori regulacije transkripcije pripadaju jednom ili drugom signalnom sistemu. Fosforilacija faktora regulacije transkripcije uzrokuje promjenu konformacije ovih proteina, njihovu aktivaciju i naknadnu interakciju sa promotorskom regijom određenog gena, što dovodi do promjene intenziteta njegove ekspresije (indukcije ili represije), au ekstremnim slučajevima , na "uključivanje" nekih tihih gena ili "isključivanje" aktivnih. Reprogramiranje ekspresije totaliteta genomskih gena uzrokuje promjenu odnosa proteina u ćeliji, što je osnova njenog funkcionalnog odgovora. U nekim slučajevima, hemijski signal iz vanjskog okruženja može stupiti u interakciju s receptorom koji se nalazi unutar ćelije - u citosolu ili da -

SIGNALI

NIB

Rice. 1. Šema interakcije vanjskih signala sa ćelijskim receptorima

1,5,6- receptori koji se nalaze u plazmalemi; 2,4 - receptori koji se nalaze u citosolu; 3 - početni enzim signalnog sistema, lokalizovan u plazmalemi; 5 - receptor aktiviran pod uticajem nespecifične promene u strukturi lipidne komponente plazmaleme; SIB - proteini inducirani signalom; PGF - faktori regulacije transkripcije proteina; i|/ - promjena membranskog potencijala

Ista jezgra (slika 1). U životinjskim ćelijama takvi signali su, na primjer, steroidni hormoni. Ovaj informacioni put ima manji broj intermedijara, te stoga ima manje mogućnosti za regulaciju od strane ćelije.

U našoj zemlji se oduvijek velika pažnja poklanjala problemima fitoimuniteta. Ovom problemu posvećen je niz monografija i recenzija domaćih naučnika [Sukhorukov, 1952; Verderevsky, 1959; Vavilov, 1964; Gorlenko, 1968; Rubin et al., 1975; Metlitsky, 1976; Tokin, 1980; Metlitsky et al., 1984; Metlitsky i Ozeretskovskaya, 1985; Kursanov, 1988; Ilinskaya et al., 1991; Ozeretskovskaya et al., 1993; Korableva, Platonova, 1995; Chernov et al., 1996; Tarčevski i Černov, 2000].

Posljednjih godina posebna pažnja posvećena je molekularnim mehanizmima fitoimuniteta. To se pokazalo

Kada su biljke zaražene, aktiviraju se različiti signalni sistemi koji percipiraju, umnožavaju i prenose signale od patogena do genetskog aparata ćelija, gde se eksprimiraju zaštitni geni, omogućavajući biljkama da organizuju i strukturnu i hemijsku zaštitu od patogena. Napredak u ovoj oblasti povezan je sa kloniranjem gena, dešifrovanjem njihove primarne strukture (uključujući regione promotora), strukture proteina koje oni kodiraju, upotrebom aktivatora i inhibitora pojedinih delova signalnih sistema, kao i mutanata i transgenih biljaka sa umetnutim geni odgovorni za sintezu učesnika u prijemu, prenosu i pojačavanju signala. U proučavanju signalnih sistema biljnih ćelija važnu ulogu igra izgradnja transgenih biljaka sa promotorima gena proteina uključenih u signalne sisteme.

Trenutno se na Institutu za biohemiju najintenzivnije proučavaju signalni sistemi biljnih ćelija pod biotičkim stresom. A.N. Bach RAS, Kazanski institut za biohemiju i biofiziku RAN, Institut za fiziologiju biljaka RAN, Filijala Puščino Instituta za bioorgansku hemiju RAN, Centar "Bioinženjering" RAS, Državni univerziteti Moskve i Sankt Peterburga, Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju RAAS , Sveruski istraživački institut za fitopatologiju Ruske akademije poljoprivrednih nauka, itd.

Problem dešifrovanja molekularnih mehanizama biotičkog stresa, uključujući i ulogu signalnih sistema u njegovom razvoju, u poslednjih deset godina ujedinio je biljne fiziologe i biohemičare, mikrobiologe, genetičare, molekularne biologe i fitopatologe. Objavljen je veliki broj eksperimentalnih i preglednih članaka o različitim aspektima ovog problema (uključujući i posebne časopise: „Physiological and Molecular Plant Pathology“, „Molecular Plant – Microbe Interactions“, „Annual Review of Plant Physiology and Pathology“). Istovremeno, u domaćoj literaturi nema generalizacije radova posvećenih signalnim sistemima ćelija, što je autora dovelo do potrebe da napiše monografiju ponuđenu čitaocima.

PATOGENI I ELICITERI

Biljne bolesti uzrokuju hiljade vrsta mikroorganizama, koji se mogu podijeliti u tri grupe: virusi (više od 40 porodica) i viroidi; bakterije (Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Streptomyces) i mikroorganizmi slični mikoplazmi; gljive (niži: Plasmodiophoromycetes, Chitridomycetes, Oomycetes: viši: Ascomycetes, Basidi-omycetes, Deuteromycetes).

Ovi zaštitni enzimi: fenilalanin amonijak liaza i anionska peroksidaza. Oblici bez krila koji pripadaju ovoj podklasi pojavili su se kao rezultat gubitka ovih organa tokom evolucije krilatih oblika. Podklasa obuhvata 20 redova insekata, među kojima su polifagi koji nemaju biljnu specifičnost, oligofagi i monofagi, kod kojih je izražena specifičnost interakcije između patogena i biljke domaćina. Neki insekti se hrane lišćem (cijela lisna ploča ili skeletizira list), drugi se hrane stabljikom (uključujući grizući stabljiku iznutra), jajnicima cvijeta, plodovima i korijenjem. Lisne uši i cikade sišu sok iz provodnih sudova uz pomoć proboscisa ili stajleta.

Rice. 2. Šema interakcije ćelije patogena sa biljkom domaćinom

/ - kutinaza; 2 - proizvodi razgradnje komponenti kutikule (moguće sa signalnim svojstvima); 3 - (3-glukanaza i druge glikozilaze koje izlučuje patogen; 4 - elicitori - fragmenti ćelijskog zida (CS) domaćina; 5 - hitinaze i druge glikozilaze koje djeluju destruktivno na CS patogena; 6 - elicitori - fragmenti CS patogena; 7 - fitoaleksini - inhibitori proteinaza, kutinaza, glikozilaze i drugih enzima patogena; 8 - toksične supstance patogena; 9 - jačanje CS domaćina zbog aktivacije peroksidaza i pojačanja sinteze lignina, taloženja hidroksiprolinskih proteina i lektina; 10 - induktori preosjetljivosti i nekroze susjednih stanica; // - produkti razgradnje kutina koji djeluju na stanicu patogena

Rice. 3. Fitotoksično jedinjenje iz Cochlio-bolus carbonum

Bakterije i gljive također stvaraju neselektivne toksine, posebno fusicoccin, erihoseten, coronatin, faz-olotoksin, syringomycin, tabtoxin.

Jedan od toksina specifičnih za domaćina koje luči Pyrenophora triticirepentis je protein od 13,2 kDa, drugi su proizvodi sekundarnog metabolizma sa širokim spektrom struktura - to su poliketidi, terpenoidi, saharidi, ciklički peptidi, itd.

U potonje po pravilu spadaju peptidi čija se sinteza odvija izvan ribozoma i koji sadrže ostatke D-aminokiselina. Na primjer, toksin specifičan za domaćina iz Cochliobolus carbonum ima strukturu tetrapeptidnog prstena. (D- npo- L- ana- D- ana- L- A3 JJ), pri čemu posljednja skraćenica označava 2-amino-9,10-epoksi-8-okso-de-kanojsku kiselinu (slika 3). Toksin se proizvodi u ćelijama patogena pomoću sintaze toksina. Otpornost na ovo jedinjenje u kukuruzu zavisi od gena koji kodira NADPH zavisnu karbonil reduktazu, koja smanjuje karbonilnu grupu, što rezultira

Elicitori igraju ulogu primarnih signala i pokreću složenu mrežu procesa indukcije i regulacije fitoimuniteta. To se manifestuje u sintezi zaštitnih proteina, neisparljivih biljnih antibiotika - fitoaleksina, u izolaciji antipatogenih isparljivih jedinjenja, itd. Trenutno je okarakterisana struktura mnogih prirodnih elicitora. Neke od njih proizvode mikroorganizmi, druge (sekundarni elicitori) nastaju enzimskim cijepanjem visokopolimernih spojeva kutikule i polisaharida staničnih zidova biljaka i mikroorganizama, a treći su fitohormoni stresa čija se sinteza u biljkama induciran je patogenima i abiogenim stresorima. Među najvažnijim elicitorima su proteinska jedinjenja koja izlučuju patogene bakterije i gljive, kao i proteini omotača virusa. Mali (10 kDa), konzervativni, hidrofilni, cisteinom obogaćeni elicitini koje luče sve proučavane vrste Phytophthora i Pythium mogu se smatrati najviše proučavanim proteinskim elicitorima. To uključuje, na primjer, kriptogein.

Elicitini izazivaju preosjetljivost i odumiranje zaraženih stanica, posebno kod biljaka iz roda Nicotiana. Najintenzivnije stvaranje elicitina od strane fitoftore događa se tokom rasta mi-

Utvrđeno je da su elicitini sposobni za transport sterola kroz membrane, budući da imaju mjesto vezanja sterola. Mnoge patogene gljive nisu u stanju da same sintetiziraju sterole, što objašnjava ulogu elicitina ne samo u ishrani mikroba, već i u izazivanju odbrambenih odgovora biljaka. Iz Phytophthora je izolovan glikoproteinski elicitor od 42 kDa. Njegovu aktivnost i vezivanje za proteinski receptor plazma membrane, čiji je monomerni oblik protein od 100 kDa, osiguran je oligopeptidnim fragmentom od 13 aminokiselinskih ostataka. Iz fitopatogene gljive Cladosporium fulvum dobijen je rasno-specifičan elicitor peptid koji se sastoji od 28 aminokiselinskih ostataka sa tri disulfidne grupe, a peptid je formiran od prekursora koji sadrži 63 aminokiseline. Ovaj faktor avirulencije pokazao je strukturnu homologiju sa nizom malih peptida, kao što su inhibitori karboksipeptidaze i blokatori jonskih kanala, i vezan za protein receptora plazma membrane, očigledno uzrokujući njegovu modulaciju, dimerizaciju i prenos signalnog impulsa na signalne sisteme. Veći predprotein Cladosporium fulvum od 135 aminokiselina se post-translaciono procesira u elicitor protein od 106 aminokiselina. Elicitor proteini koje proizvodi gljiva rđe Uromyces vignae su dva mala polipeptida od 5,6 i 5,8 kDa, za razliku od drugih elicitina u svojstvima. Među bakterijskim proteinskim elicitorima, harpini su najviše proučavani. Mnoge fitopatogene bakterije proizvode elicitor oligopeptide (njihov sintetički

Sky analogi), koji odgovaraju najkonzerviranijim regijama proteina - flagelina, koji je važan faktor virulencije ovih bakterija. Iz Erwinia amylovora izolovan je novi protein elicitor, čija je C-regija homologna enzimu pektat liaze, što može uzrokovati pojavu oligomernih fragmenata elicitora - produkata razgradnje pektina. Patogena bakterija Erwinia carotovora izlučuje elicitor protein harpin i enzime pektat liazu, celulazu, poligalakturonazu i proteaze koji hidroliziraju polimerne komponente staničnih zidova biljke domaćina (vidi sliku 2), što rezultira stvaranjem oligomernih molekula. Zanimljivo je da je pektat liaza koju luči Erwinia chrysanthemi stekla aktivnost kao rezultat ekstracelularne obrade.

Neki lipidi i njihovi derivati također pripadaju elicitorima, posebno 20-ugljičnim polinezasićenim masnim kiselinama nekih patogena - arahidonske i eikozapentaenske [Ilyinskaya et al., 1991; Ozeretskovskaya et al., 1993; Ozeretskovskaya, 1994; Gilyazetdinov et al., 1995; Ilyinskaya et al., 1996a, b; Ilyinskaya, Ozeretskovskaya, 1998] i njihovi oksigenirani derivati. Pregledni rad [Ilyinskaya et al., 1991] sažima podatke o elicitorskom efektu lipida (lipoproteina) koje proizvode patogene gljive na biljke. Ispostavilo se da izazivajuće djelovanje nije proteinski dio lipoproteina, već njihov lipidni dio, a to su arahidonska (eikozatetraenska) i eikozapentaenska kiselina, koje nisu karakteristične za više biljke. Izazvali su stvaranje fitoaleksina, nekrozu tkiva i sistemsku rezistenciju biljaka na razne patogene. Proizvodi konverzije lipoksigenaze u biljnim tkivima C20 masnih kiselina (hidroperoksi-, hidroksi-, okso-, ciklički derivati, leukotrieni), koji se formiraju u ćelijama biljke domaćina pomoću enzimskog kompleksa lipoksigenaze (čiji supstrati mogu biti oboje C, 8 i C 20 polienske masne kiseline), imale su snažan uticaj na odbrambeni odgovor biljaka. Ovo je očigledno zbog činjenice da nema kiseonika u nezaraženim biljkama.
derivata 20-ugljičnih masnih kiselina, a njihova pojava kao posljedica infekcije dovodi do dramatičnih rezultata, na primjer, do stvaranja nekroze oko inficiranih stanica, što stvara barijeru širenju patogena po biljci.

Postoje dokazi da je indukcija aktivnosti lipoksigenaze od strane patogena dovela do formiranja biljnog odgovora čak i u slučaju kada elicitor nije sadržavao C20 masne kiseline, a samo nativne C18 polienske masne kiseline mogle bi biti supstrat aktivnosti lipoksigenaze, a proizvodi mogu biti oktadekanoidi, a ne eikozanoidi. Syringolidi takođe imaju svojstva izazivanja [L et al., 1998] i cerebrozidi - sfingolipidna jedinjenja. Cerebrozidi A i C izolirani iz Magnaporthe grisea bili su najaktivniji elicitori za biljke riže. Proizvodi degradacije cerebrozida (metil estri masnih kiselina, sfingoidne baze, glikozil-sfingoidne baze) nisu pokazali elicitornu aktivnost.

Jedna takva barijera je kutikula, koja se uglavnom sastoji od heteropolimera kutina ugrađenog u vosak. Pronađeno je više od 20 monomera koji čine kutin. To su zasićene i nezasićene masne kiseline i alkoholi različite dužine, uključujući hidroksilirane i epoksidirane, dugolančane dikarboksilne kiseline itd. U kutinu, većina primarnih alkoholnih grupa učestvuje u formiranju etarskih veza, kao i neke od sekundarnih alkoholnih grupa koje obezbeđuju poprečne veze između lanaca i tačaka grananja u polimeru. Dio drugog polimera "prepreke", suberina, po sastavu je blizak kutinu. Njegova glavna razlika je u tome što su slobodne masne kiseline glavna komponenta suberičnih voskova, dok ih je u kutinu vrlo malo. Osim toga, u pod

Tu su uglavnom C 22 i C 24 masni alkoholi, dok kutin sadrži C 26 i C 28. Kako bi prevladale površinsku mehaničku barijeru biljaka, mnoge patogene gljive luče enzime koji hidroliziraju kutin i neke od komponenti suberina. Proizvodi kutinazne reakcije su različite oksigenirane masne kiseline i alkoholi, uglavnom 10,16-dihidroksi-Cr- i 9,10,18-trihidroksi-S|8-kiseline, koje su signalni molekuli koji induciraju stvaranje i oslobađanje dodatnih količine kutinaze, koje "nagrizaju" kutin i olakšavaju prodiranje gljivice u biljku. Utvrđeno je da je period kašnjenja za pojavu mRNA kutinaze u gljivi nakon početka formiranja navedenih di- i trihidroksi kiselina bio samo 15 min, dok je oslobađanje dodatne kutinaze dvostruko duže. Oštećenje gena kutinaze kod Fusarium solani uvelike je smanjilo virulentnost ove gljive. Inhibicija kutinaze hemikalijama ili antitijelima spriječila je infekciju biljaka. Pretpostavka da oksigenirani proizvodi razgradnje kutina mogu djelovati ne samo kao induktori stvaranja kutinaze kod patogena, već i kao pokretači odbrambenih reakcija u biljci domaćinu [Tarchevsky, 1993], naknadno je potvrđena.

Posebne studije su pokazale da tokom interakcije bakterija i tkiva biljke domaćina dolazi do enzima

Degradacije se ne pojavljuju istovremeno. Na primjer, pektilmetilesteraza je također bila prisutna u neinokuliranoj Erwinia carotovora subsp. atroseptia u tkivima gomolja krompira, dok su se aktivnosti poligalakturonaze, pektatalijeze, celulaze, proteaze i ksilanaze pokazale 10, 14, 16, 19, odnosno 22 sata nakon inokulacije.

Pokazalo se da proizvodi razgradnje oligosaharida polisaharida biljnog zida imaju svojstva izazivanja. Ali aktivne oligosaharide mogu formirati i polisaharidi koji su dio staničnih zidova patogena. Poznato je da je jedan od načina zaštite biljaka od patogenih mikroorganizama stvaranje nakon infekcije i oslobađanje van plazmaleme enzima - hitinaze i?-1,3-glukanaze, koji hidroliziraju polisaharide hitin i inhibiciju njihovog rasta i razvoja. . Utvrđeno je da su oligosaharidni produkti takve hidrolize također aktivni pokretači odbrambenih reakcija biljaka. Kao rezultat djelovanja oligosaharida povećava se otpornost biljaka na bakterijske, gljivične ili virusne infekcije.

Ksiloglukan oligosaharid sa anti-auksinskim djelovanjem.

Dešifrovana je struktura niza fiziološki aktivnih oligosaharida: razgranati heptaglukozid dobijen iz ćelijskih zidova patogene gljive [Elbersheim, Darvill, 1985]; penta- i heksameri N-acetil-glukozamina dobijeni hidrolizom hitina, kao i glukozamin koji nastaje hidrolizom hitozana; 9-13-dimenzionalni linearni oligogalakturonidi nastali tokom hidrolize pektinskih supstanci; dekagalakturonid sa 4-5 nezasićenim terminalnim galakturonozilnim ostatkom; oligogalakturnozidi sa stepenom polimerizacije 2-6, koji pokazuju određenu aktivnost. Podaci o fiziološki aktivnim ksiloglukanima dobijenim iz hemiceluloza sa stepenom polimerizacije 8-9, hitobioze, hito-trioze i kitotetroze, razgranatih ksiloglukanskih fragmenata formule Glu(4)-Xi(3)-Gal(1 ili 2)-Fuc i njihovi prirodni O-acetilirani derivati. Utvrđeno je da razgranati p-glukozid ima najveću aktivnost induciranja fitoaleksina. Hemijska modifikacija ovog oligosaharina ili promjena u prirodi grananja dovela je do smanjenja elicitornih svojstava.

Proučavanje mehanizma djelovanja oligosaharida na biljke omogućilo je da se utvrdi da spektar odgovora ovisi o koncentraciji i strukturi ispitivanih tvari. Razni elicitori oligosaharida pokazuju najveću aktivnost pri različitim koncentracijama. Na primjer, indukcija sinteze zaštitnih spojeva (hitinaza) u kulturi stanica riže bila je maksimalna pri koncentraciji N-acetilhitoheksaoze od 1 μg/ml, dok je isti učinak postignut u slučaju 10 puta veće koncentracije.

Utvrđeno je da je stepen otpornosti biljaka na patogen određen (zajedno sa drugim faktorima) odnosom različitih polisaharida u zidovima biljnih ćelija. O tome se može suditi na osnovu poređenja rezistentnih i osjetljivih na patogen Colletotrichum linde-
linije graha muthianum koje su bile izložene patogenu endopoligalakturonazi. Izolovani su oligomerni fragmenti pektina; pokazalo se da kod otporne sorte preovlađuju ostaci neutralnih šećera, a kod nestabilne galakturonatne.

Nedavno su dobijeni rezultati koji ukazuju na to da oligogalakturonatni fragmenti nastaju u biljkama ne samo pod uticajem enzima patogena koji razgrađuju pektin, već i kao rezultat ekspresije gena poligalakturonaze u ćelijama domaćina kao odgovor na sistemske i oligosaharidne elicitore.

Skreće se pažnja na višesmjernu regulaciju zaštitnog odgovora stanica produktima razgradnje polisaharida stanične stijenke. Pokazalo se da su mali oligogalakturonidi sa stepenom polimerizacije 2-3 aktivni elicitori, a fragmenti ramnogalakturonskih pektina sa visokim stepenom polimerizacije supresori formiranja hidroksiprolinskih proteina ćelijskih zidova. Drugim riječima, procesi degradacije u ćelijskim zidovima uzrokovani patogenima mogu regulisati (kao rezultat složenog niza reakcija ćelijskih signalnih sistema) biosintetičke procese koji povećavaju stabilnost ćelijskih zidova zbog akumulacije proteina hidroksiprolina i stvaranja kovalentne veze između njih.

Fragmenti ksiloglukana koji sadrže fukozu (tri- i pentasaharidi) posjedovali su imunosupresivna svojstva, ali kada je ksiloza zamijenjena drugim monosaharidom, supresorska aktivnost je promijenjena u elicitornu aktivnost [Ilyinskaya et al., 1997]. Lišavanje oligosaharida fukoze lišilo ga je i supresorskih i elicitornih svojstava. Niske aktivne doze i visoka selektivnost specifičnih supresora ukazuju na receptorsku prirodu njihovog djelovanja [Ozeretskovskaya, 2001].

Postoje i drugi primjeri proizvodnje od strane patogena ne samo elicitora, već i supresora odbrambenih reakcija biljaka. Tako su pycnoseurs Mycosphaerella pinodes izolovali obje vrste takvih spojeva.

Treba napomenuti da su oligosaharidni fragmenti polisaharida staničnih zidova biljaka i gljiva.

Prenesite na rasno nespecifične elicitore, uzrokujući nespecifične zaštitne odgovore zaraženih biljaka. Ovo je sasvim razumljivo, jer se tokom razgradnje polisaharida formira širok spektar oligosaharida u kojima je specifičnost vrste patogena ili domaćina vrlo slabo izražena. U isto vrijeme, proteinski (ili peptidni) faktori virulencije bakterija, koje prepoznaju "njihovi" receptori biljnih stanica, su specifični za rasu. Posljednja vrsta interakcije naziva se genetski ping-pong, ili interakcija "gen-na-gen", budući da je specifičnost elicitora ili receptora određena genima koji ih kodiraju, a određuje se otpornost ili osjetljivost biljaka na patogen. sposobnošću receptora da prepozna elicitor.

Za proučavanje mehanizama odgovora biljnih stanica na djelovanje elicitora često se ne koriste pojedinačni oligosaharidi, već mješavina oligosaharida koja nastaje tijekom hidrolize polisaharida staničnih zidova patogenih gljiva. Ovakav pristup je opravdan s obzirom da već u prvim trenucima infekcije patogenima na biljne stanice može utjecati ne jedan, već više elicitora. Inače, postoji relativno malo radova posvećenih proučavanju karakteristika djelovanja nekoliko elicitora istovremeno. Na primjer, pokazalo se da elicitini paraziticein i kriptogain, kao i oligosaharidni elicitori iz ćelijskih zidova, izazivaju brzu aktivaciju protein kinaze tipa 48 kDa SIP i fenilalanin amonijum liaze u duhanu. Istovremeno, elicitini, a ne oligosaharidi, aktivirali su protein kinazu od 40 kDa. Glukan i Ca 2+ pojačavaju dejstvo arahidonata i eikozapentaenoata. Činjenica da EGTA (specifični Ca 2+ ligand) inhibira sintezu fitoaleksina sugerira da ioni kalcija igraju važnu ulogu u regulaciji zaštitne funkcije biljaka. Moguće je da su proizvodi razgradnje proteina stanične stijenke bogatih hidroksiprolinskim ostacima i koji sadrže oligoglikozilne grane također signalne tvari.

ELICITOR RECEPTORS

Već je u uvodu spomenuto da receptori elicitornog signala mogu biti locirani i u ćelijskoj membrani, i u citosolu, i u jezgru, ali nas posebno zanima prvi, najčešći slučaj, kada sam elicitor ne prodire. u ćeliju, ali stupa u interakciju sa ekstracelularnim dijelom receptora proteina plazma membrane, koji je prva karika u složenom lancu signalnih događaja koji kulminiraju odgovorom ćelije na promijenjene uslove postojanja. Broj molekularnih antena jedne vrste ćelijskih plazmalemnih receptora, po svemu sudeći, može doseći nekoliko hiljada. Broj tipova molekularnih antena ostaje nepoznat, ali se može tvrditi da imaju jedinstvena osnovna strukturna svojstva. Imaju tri glavna domena: eksterni varijabilni N-terminalni domen (akceptor u odnosu na elicitore), transmembranski sa visokim sadržajem hidrofobne aminokiseline leucina i citoplazmatski varijabilni C-terminalni domen, čija struktura određuje prijenos signalnog impulsa na određeni signalni sistem. Receptor može biti specifičan za samo jednu vrstu elicitora ili za grupu srodnih (npr. oligomernih) elicitora. Opisano je nekoliko tipova receptorskih proteina staničnih membrana životinja: kod nekih receptora transmembranski proteinski lanac prelazi membranu samo jednom, kod drugih (serpentinski) sedam puta, kod trećih interakcija sa elicitorskim ligandom dovodi do stvaranja homo- ili heterodimer (oligomer), koji je i primarni pretvarač vanjskog signala. Struktura proteina receptora plazma membrane biljaka je u manjoj mjeri proučavana, ali su principi njihove konstrukcije isti.

ATP

ATP

Rice. 4. Šema strukture dvokomponentnog receptora za signalne sisteme

a - jednostavni receptor; b - multifunkcionalni receptor. 1 - "ulazni" domen; 2 - autokinazni histidin domen; 3 - prijemna domena regulatora odgovora; 4 - "izlazni" domen regulatora odgovora; 5 - domen koji nosi fosfat koji sadrži histidin; A - ostatak asparaginske kiseline; G - ostatak histidina; P je ortofosfatni ostatak koji se prenosi tokom reakcija kinaze. Eksterni signal je označen simbolom munje

Isto kao i životinjske ćelije. Posebnu pažnju privlači dvokomponentna struktura receptora, koja ima svojstva protein kinaze (slika 4). Prvo je pronađen u prokariotskim organizmima, a zatim, u izmijenjenom obliku, u eukariotskim organizmima, uključujući biljke, kao što je Arabidopsis. Ako su u prvom slučaju dvije komponente - stvarni receptor i izvršna - nezavisne, iako u interakciji, proteinski molekuli, onda su u drugom dva domena istog proteina.

Potvrda uloge interakcije elicitor-receptor u prenošenju i transformaciji signala iz patogena u genom bilo je uspostavljanje pozitivne korelacije između sposobnosti elicitora da se nekovalentno vežu za receptore i induciraju zaštitni odgovor ćelije, npr. nakupljanje fitoaleksina. Vezivanje za spoljašnji deo proteinskih receptora plazma membrane bilo je karakteristično za oligosaharide elicitore biljnih ćelijskih zidova, oligohitinski fragmenti ćelijskih zidova gljivica, elicitor proteine i peptide, siringolide, stres fitohormone sistemin, etilen, apscizinomonat, metil brasilnomonat i metil branastomonat. U potonjem slučaju postoji fundamentalna razlika od životinjskih ćelija, u kojima se receptori steroidnih hormona nalaze u jezgru.

Izolovani su brojni receptori elicitor membranskih proteina. Da bi se to postiglo, nakon što se označeni elicitori vežu na receptore, membrane se oslobađaju iz ćelija, uništavaju, a protein sa zadržanim elicitorom se identifikuje po njegovoj radioaktivnosti. Utvrđeno je, na primjer, da je sisteminski receptor protein od 160 kDa, bakterijski flagelin elicitor - membranski protein od 115 kDa, glikoprotein iz ćelijskog zida fitoftore, koji ima signalni oligopeptidni fragment od 13 aminokiselinskih ostataka -91 kDa ili 100 kDa.

Koncept molekularne interakcije gen-za-gen između patogena i biljaka često pretpostavlja indirektno (posredovano signalnim sistemima) prepoznavanje gena avirulencije patogena (avr gen) od strane odgovarajućeg gena otpornosti (R gen) biljne ćelije.

Model elicitor-receptor bio je molekularna osnova interakcije "gen za gen" između patogena i biljke. Receptorski proteini su izolovani i pročišćeni, a geni koji kodiraju ove proteine su klonirani. Postoji niz recenzija posvećenih strukturi receptorskih proteina

Pokazalo se da mnogi od njih imaju slične konzervirane ponavljanja obogaćene leucinom (od 12 do 21) potrebne za interakciju protein-protein. Ova ponavljanja omogućavaju vezivanje proteina receptora R za elicitore. Studije mutanata sa smanjenom otpornošću na patogene bakterije uzrokovane zamjenom glutamata za lizin u jednom od leucinskih ponavljanja potvrđuju da je interakcija protein-protein važna karika u transformaciji i prijenosu elicitornih signala u genom stanice.

Trenutno je prihvaćeno nekoliko modela strukture receptora i načina prenošenja elicitornog signala izvana u unutrašnjost biljne ćelije. U Arabidopsisu je pronađena porodica od 35 serpentinskih receptora. Receptor percipira signalni molekul preko N-terminalnog mjesta na vanjskoj strani membrane i prenosi signalni impuls u citoplazmu preko unutrašnjeg C-mjesta. Vezivanje signalne molekule dovodi do promjene konformacije cijele receptorske molekule, što dovodi do aktivacije s njim povezanih proteinskih molekula u citoplazmi, koji vrše transformaciju signala.

Jedan od fundamentalno važnih mehanizama koji se koriste u ćelijskim signalnim sistemima je dimerizacija (oligomerizacija) nekih proteinskih intermedijara ovih sistema. Primjeri uključuju dimerizaciju receptora nakon vezivanja liganda za njih, dimerizaciju nekih intermedijara signalnog sistema i dimerizaciju faktora regulacije transkripcije. Uočene su i homo- i heterodimerizacija (oligomerizacija). Kod životinja je tipičan mehanizam dimerizacije receptora tirozin kinaze stanične membrane, na primjer, za transdukciju polipeptidnih hormona (placentalni faktor rasta itd.). Receptori serin/treonin kinaze funkcionišu na sličan način. Malo se zna o tome koji su oblici receptora - monomerni, homodimerni ili heterodimerni - uključeni u transformaciju elicitornih signala u biljnim ćelijama. Šema heterodimernog re-
receptor, koji se aktivira ligandom, što dovodi do fosforilacije domena citosolne kinaze i aktivacije proteina povezanih s njim, od kojih neki prenose signalni impuls sljedećim intermedijerima signalnih sistema. Jedan od povezanih proteina je protein fosfataza, koja inaktivira domen kinaze.

U životinjskim ćelijama, receptor tirozin kinaze se sastoji od tri domena: ekstracelularnog, transmembranskog i citosolnog. Specifičnost strukture prvog i trećeg domena (na primjer, da nisu u stanju da se fosforiliraju) određuje, s jedne strane, s kojim hormonom receptor u interakciji, a s druge strane, s kojim signalnim sistemima ovaj hormon " uključuje". Interakcija vanjskog domena sa signalnim ligandom dovodi do autofosforilacije tirozinskog ostatka ovog domena, što povećava njegovu kinaznu aktivnost. Tipično, protein kinaze sadrže višestruka mjesta fosforilacije. Ovo se također odnosi na receptorske proteinske kinaze. Citoplazmatski domen monomernog oblika receptora faktora rasta u životinjskim ćelijama sadrži najmanje devet autofosforiliranih tirozinskih ostataka. Jedan od njih, Tyr 857, važan je za ispoljavanje aktivnosti kinaze, a osam drugih određuje specifičnost veze sa molekulima koji transformišu signal. Postoje razlozi za vjerovanje da se isti principi funkcioniranja receptora također koriste u biljnim stanicama, međutim, oni se nalaze uglavnom u protein kinazama receptora serin-treonin uključenih u odbrambene reakcije biljaka izazvane patogenom.

Trenutno je 18 receptorskih serin-treonin protein kinaza Arabidopsis podijeljeno u četiri grupe ovisno o strukturi njihovog ekstracelularnog domena:

1. Protein kinaze sa domenima obogaćenim leucinskim ponavljanjima, obično karakterističnim za fragmente uključene u protein-protein interakcije. Kod životinja, takvi receptori vezuju polipeptidne (ili peptidne) signalne molekule. Pretpostavlja se da ova grupa uključuje brasinolidne receptore sa obogaćenim

Mi leucin se ponavlja u N-terminalnoj epimembranskoj regiji. Gen za sličan protein izolovan je iz paradajza, ali bez domena citosolne kinaze.

2. Protein kinaze sa S-domenima, koje sadrže
mnogo ostataka cisteina.

Protein kinaze sa domenima bogatim leucinom
ponavlja, ali je, za razliku od prve grupe, povezan
nye sa lektinima. Ovo stvara mogućnost prijema od strane ovih
protein kinaze oligosaharidnih elicitora.
Protein kinaze povezane sa ćelijskim zidom.

Ove grupe nisu uključivale neke protein kinaze, posebno protein kinazu koja ima ekstracelularnu domenu koja se vezuje za protein koji se akumulira u međućelijskom prostoru kada su biljke inficirane raznim patogenima. Kao što je već napomenuto, mnoge receptorske kinaze mogu stupiti u interakciju s drugim proteinima, a to obezbjeđuje i veći izbor vezujućih hemijskih signala i regulaciju ovih procesa. Moguće je da je pomenuta protein kinaza jedan od receptorskih proteina odgovornih za odbrambene reakcije biljaka.

Jedan od drevnih, konzervativnih i široko rasprostranjenih tipova membranskih receptora su transmembranske autofosforilirajuće histidin kinaze, koje se mogu aktivirati širokim spektrom signalnih molekula elicitora. Vezivanje elicitora za spoljašnji N-terminalni region receptora koji strši iznad lipidnog sloja plazmaleme izaziva promenu njegove konformacije i autofosforilaciju histidinskog ostatka (vidi sliku 4). Tada se ostatak fosforne kiseline prenosi na aspartatnu reziduu unutrašnjeg (citoplazmatskog) proteinskog regiona, što takođe uzrokuje promjenu njegove konformacije i kao rezultat toga aktivaciju enzima povezanog s receptorom (direktno ili preko posrednika - najčešće G-proteini). Aktivacija enzima je najvažnija karika u signalnom sistemu, čija je svrha prijenos i umnožavanje elicitornog signala, koji kulminira ekspresijom zaštitnih gena i pojavom proteina koji

Određuje se odgovor stanica i biljke u cjelini na infekciju i izloženost elicitorima. Specifičnost receptora za elicitore određena je varijabilnim vanjskim N-terminusom proteina, dok je specifičnost za enzim određena njegovim unutrašnjim C-terminusom. Pokazalo se da ovaj tip receptora stupa u interakciju sa stresnim fitohormonom etilenom IBleecker et al., 1998; Hua i Meyerowitz 1998; Theologis, 1998; Woeste i Kieber 1998; Alonso et al., 1999; Chang, Shockey, 1999; A.E. Hall et al., 1999; Hirayama et al., 1999; Cosgrove et al., 2000; Savaldi-Goldstein, Fluhr, 2000; et al.], koji izaziva zaštitne reakcije biljnih ćelija. Kloniranje i određivanje primarne strukture gena histidinskog receptora u Arabidopsisu pokazalo je da je njegov N-terminalni membranski domen sličan transporterima metalnih jona.

Trenutno je opisan protein transmembranskog receptora, čiji N-terminus je u interakciji sa ćelijskim zidom, a C-terminus se nalazi u citoplazmi i ima svojstva serin-treonin protein kinaze. Prema autorima, ovaj receptorski protein obavlja signalne funkcije, obezbeđujući signalni kontakt između ćelijskog zida i unutrašnjeg sadržaja ćelije.

Budući da se interakcija između signalne molekule i receptora odvija bez pojave kovalentnih veza između njih, ne može se isključiti mogućnost njihovog razdvajanja. S druge strane, povezanost ova dva tipa molekula može biti prilično jaka, a promjena konformacije receptorskog proteina stvara preduvjete za olakšavanje napada proteaza koje prepoznaju proteine poremećene strukture i uništavaju te molekule. U tom smislu, sposobnost ćelija da brzo obnove broj receptora različitih tipova je od velike važnosti. Pažnju se skreće na eksperimente posvećene proučavanju uticaja inhibitora sinteze proteina na intenzitet vezivanja elicitora za receptorske proteine plazmaleme. Pokazalo se da je tretman ćelija cikloheksimidom, inhibitorom sinteze proteina koji uključuje citoplazmatske ribozome, uzrokovao prilično brzo smanjenje nivoa sistemskog vezivanja od strane ćelija, što ukazuje na oslobađanje

Visoka stopa obrtanja receptorskog proteina od 160 kDa Postoje podaci o sintezi receptora lociranih u plazmalemi izazvanoj elicitorom, ali, koliko je poznato, još uvijek nema informacija o stepenu specifičnosti sinteze određeni receptorski protein u zavisnosti od vrste elicitora.

Tarchevsky I.A. Signalni sistemi biljnih ćelija - fajl n1.doc

n1.doc