Исследование качества воды методом биотестирования. Методические рекомендации по применению методов биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения

Проблемы чистой воды и охраны гидросферы становятся все более острыми по мере развития научно-технического прогресса. Уже сейчас во многих районах земного шара наблюдаются большие трудности в обеспечении водопотребления и водопользования вследствие количественного и качественного истощения водных ресурсов. В первую очередь это связано с загрязнением водоемов и забором из них больших объемов воды (зарегулирование, переброска части стока рек и др.), ведущегося в интересах энергетики, орошения земель, навигации и в других целях.

Настоящая работа была выполнена по заданию Воронежского Областного Комитета по экологии и охране природных ресурсов. В его штате отсутствуют гидробиологи, однако результаты гидробиологического тестирования сточных вод очень важны и интересуют Комитет. Пробы для тестирования были предоставлены лабораторией Комитета, а небольшое количество дафний для разведения и дальнейшего использования в опытах – кафедрой зоологии беспозвоночных Воронежского государственного университета.

Для тестирования были взяты стоки вод в прудах-отстойниках шести сахарных заводов области.

Результаты экспериментов переданы в Областной Комитет по экологии и охране природных ресурсов.

Современное состояние проблемы загрязнения водоемов и очистки сточных вод

Загрязнение водоемов в наибольшей степени связано со сбросом в них промышленных, сельскохозяйственных и бытовых стоков, с попаданием загрязняющих веществ из атмосферы и в результате деятельности человека на самих водоемах. Во многих водоемах загрязнение настолько велико, что привело к полной деградации их экосистемы, потере их хозяйственной и ландшафтной ценности.

Под загрязнением водоемов понимается ухудшение их экономического значения и биосферных функций в результате антропогенного поступления в них вредных веществ.

Из загрязняющих веществ наибольшее значение для водных экосистем имеет нефть и продукты ее переработки, пестициды, соединения тяжелых металлов, детергенты, антисептики. Чрезвычайно опасным стало загрязнение водоемов радионуклидами. Значительную роль в загрязнении водоемов играют бытовые стоки, лесосплав, отходя деревообрабатывающих предприятий и многие другие загрязнения, не относящиеся к токсическим, но ухудшающие среду гидробионтов.

Сточные воды – это воды, использованные на бытовые, производственные и другие нужды и загрязненные различными примесями, изменившими их первоначальный химический состав и физические свойства, а также воды, стекающие с территории населенных пунктов и промышленных предприятий в результате выпадения атмосферных осадков или поливки улиц.

В зависимости от происхождения, вида и состава сточные воды подразделяются на три основные категории:

1. Бытовые (от туалетных комнат, кухонь, столовых, больниц. Они поступают от жилых и общественных зданий, а также от бытовых помещений промышленных предприятий)

2. Производственные (воды, использованные в технических процессах, не отвечающие более требованиям, предъявляемым к их качеству)

3. Атмосферные (дождевые и талые, вместе с атмосферными отводятся воды от полива улиц, от фонтанов и дренажей)

Сточные воды представляют собой сложные гетерогенные смеси, содержащие примеси органического и минерального происхождения, которые находятся в нерастворенном, коллоидном и растворенном состоянии. Степень загрязнения сточных вод оценивается концентрацией, т. е. массой примесей в единице объема (мг/л). Наиболее сложны по составу сточные воды промышленных предприятий. На формирование производственных сточных вод влияют перерабатываемое сырье, технический процесс производства, применяемые реагенты, промежуточные изделия и продукты, состав исходной воды, местные условия и др.

Эти воды могут различаться по концентрации загрязняющих веществ, по степени агрессивности и т. д.

Водоемы загрязняются в основном в результате спуска в них сточных вод от промышленных предприятий и населенных пунктов. В результате сброса сточных вод изменяются физические свойства воды (повышается температура, уменьшается прозрачность, появляются привкусы, окраска, запахи), на поверхности водоемов появляются плавающие вещества, а на дне образуются осадки, изменяется химический состав воды (увеличивается содержание органических и неорганических веществ, появляются токсические вещества, уменьшается содержание кислорода, изменяется активная реакция среды и др.), изменяется качественные и количественные бактериальный состав, появляются болезнетворные бактерии. Загрязненные водоемы становятся непригодными для питьевого и технического водоснабжения, теряют рыбохозяйственное значение.

Первые шаги к усовершенствованию процесса очистки сточных вод связано с прямым использованием природного самоочищения и фильтрационной способности почвы. Уже в 19 столетии вокруг крупных промышленных центров были выделены специальные земельные участки, которые служили для очистки сточных вод. Они получили название полей фильтрации и полей орошения. Но длительность срока очистки и большие земельные площади делают эти способы малоэкономичными при быстро развивающемся производстве. При таком способе очистки возникают так же определенные санитарно-эпидемиологические трудности.

Следующим этапом развития способов очистки сточных вод было использование биологических прудов. Процесс очистки воды в них проходит по принципу естественного очищения обычного для водоемов и только отчасти регулируется человеком. Так очищаются стоки мясокомбинатов, молочных и сахарных заводов, кондитерских и других предприятий. Нередко такие пруды обеспечиваются принудительной аэрацией и циркуляцией воды. Отрицательным моментом работы биопрудов является длительность процесса очистки, который продолжается до 30 суток. Процесс очистки считается окончательным при следах азота аммонийного в воде.

Технический прогресс и все усиливающийся процесс индустриализации привели уже в начале 20 века к необходимости изыскать более быстрые и экономичные методы очистки сточных вод.

Методы искусственной биологической очистки, основанные на активной деятельности живых организмов, остаются в настоящее время основными экономичными и эффективными, обеспечивающие наиболее полное разложение загрязнений по сравнению со всеми иными индустриальными методами.

3. Методы анализа и тестирования сточных вод

Среди методов гидробиологического анализа поверхностных вод сапробиологический анализ занимает одно из важнейших мест. Разработанный еще в начале 20 века ботаником Кольквитцем и зоологом Марссоном сапробиологический анализ продолжает успешно применяться в повседневной практике гидробиологического контроля качества поверхностных вод.

Первоначально под сапробностью понималась способность организмов развиваться при большем или меньшем содержании в воде органических загрязнений. Затем экспериментально было доказано, что сапробность организма обусловливается как его потребностью в органическом питании, так и резистентностью по отношению к вредным продуктам распада и дефициту кислорода в загрязненных водах.

Теперь установлено, что в ряду организмов олигосапробы-мезосапробы-полисапробы возрастает не только специфическая стойкость к органическим загрязнителям и к таким их последствиям, как дефицит кислорода, но и их неспецифическая способность существовать при резко различных условиях среды. Это положение значительно расширяет возможности использования сапробиологического анализа не только в случае загрязнения вод бытовыми стоками, но и при их промышленном загрязнении.

В классической системе показательные организмы разделяются на три группы:

1. организмы сильно загрязненных вод – полисапробионты, или полисапробы;

2. организмы умеренно загрязненных вод – мезосапробионты, или мезосапробы;

3. организмы слабо загрязненных вод – олигосапробионты, или олигосапробы.

Полисапробные воды характеризуются бедностью кислорода и большим содержанием углекислоты и высокомолекулярных легко разлагающихся органических веществ – белков, углеводов. Население полисапробных вод обладает малым видовым разнообразием, но отдельные виды могут достигать большой численности. Здесь особенно распространены бесцветные жгутиконосцы и бактерии.

Мезасапробные воды характеризуются энергичным самоочищением. Большой численностью обладают грибы, бактерии и водоросли. В этих водах обитают беспозвоночные организмы, а также нетребовательные к кислороду виды рыб. Деревенские пруды, рвы и канавы на полях орошения обычно содержат мазосапробные воды.

В олигосапробных водах процессы самоочищения протекают менее интенсивно, чем в мезосапробных. В них доминируют окислительные процессы, нередко наблюдается пресыщение кислородом, преобладают такие продукты как аммонийные соединения, нитриты и нитраты. В этих водах разнообразно представлены животные и растительные организмы.

Олигосапробные воды – это практические чистые воды больших озер. Если такие воды произошли путем минерализации из загрязненных вод, то для них характерна почти полная минерализация органических веществ.

Дафния является мезосапробным организмом. С ее помощью можно определить достаточно хорошую степень очистки сточных вод. Так как она очень чувствительна к изменениям водной среды мы можем определить и недостаточную степень очистки воды. Поэтому мы проводили биотестирование сточных вод методом Дафния.

4. Биотестирование сточных вод методом Daphnia

К настоящему времени апробированы и используются на практике большое количество предельно допустимых концентраций различных веществ, успешно внедряются в практику народного хозяйства также нормы предельно допустимых стоков.

При избыточном поступлении стоков с высокими концентрациями вредных веществ нарушаются природные качества воды, и она становится непригодной для выполнения биологических функций организма. Это отрицательно сказывается на состоянии и развитии всех водных организмов и приводит к негативным состояниям стабилизированных экосистем, структура которых в большинстве случаев упрощается.

Часть ее компонентов, в первую очередь полезных человеку, частично вымирает, а ограниченное число отдельных представителей флоры и фауны может интенсивно развиваться и способствовать ухудшению природных качеств вод.

Задача настоящей работы заключается в контроле качества сточных вод, выбрасываемых сахарными заводами области. Контроль производится одним из самых допустимых биологических методов на ветвистоусом рачке Daphnia magna из отряда листоногие раки.

Для проведения данной работы требуются следующие материалы и оборудование:

Микроскоп МБС, лупы, гидробиологический сачок для отлова дафний, сачки для переноса дафний в сосуд для биотестирования, аквариум-отсадник объемом 5 л, цилиндры мерные объемом 0,5-2 л, пипетки мерные на 1,2,10 мл, стаканы химические объемом 200,100,50 мл, воронки стеклянные, чашки Петри, фильтровальная бумага

5. Характеристика тест-объектов

Род Daphniaвключает 50 видов и имеет повсеместное распространение. В пресных водоемах нашей области широко распространены 5 видов дафний.

Рачки вида Daphnia magna имеют более крупные размеры и их применение в токсикологических экспериментах предпочтительнее. Они обитают в стоячий водоемах и слабопроточных водах, особенно часто во временных пересыхающих водоемах, лужах. На территории нашей страны распространены повсеместно, кроме Заполярья и Дальнего Востока. Являются типичными мезосапробами, переносят осоление до 6%.

Короткий биологический цикл развития позволяет проследить рост и развитие дафний на всех жизненных стадиях. В течение жизни дафнии выделяют ряд стадий, сопровождающихся линьками: первые 3 следуют через 20-24-36 часов, четвертая – созревание яиц в яичнике и пятая – откладка яиц в выводковую камеру следуют с интервалами 1 -1,5 суток. Начиная с шестой стадии, каждая линька сопровождается откладыванием яиц. Растет дафния наиболее интенсивно в первые дни после рождения, после наступления половозрелости рост замедляется. Новорожденная молодь имеет размеры 0,7-0,9 мм в длину, к моменту половозрелости самки достигают 2,2 – 2,4 мм, а самцы – 2,0 – 2,1 мм. Максимальная длина тела самок может достигать 6,0 мм.

При благоприятных условиях и в лаборатории дафнии большую часть года размножаются без оплодотворения – партеногенетически, производят потомство, состоящее из самок. При недостатке пищи, перенаселении, изменении температурных условий и уменьшения светового дня в популяции дафний появляются самцы, и дафнии переходят к половому размножению, откладывая после оплодотворения «зимние яйца» (1-2) в эфиппиум, образованный из части створок раковины самок.

Период созревания рачков при оптимальной температуре 20-220С с хорошим питанием – 5 -8 дней. Длительность эмбрионального развития обычно 3-4 дня, а при повышении температуры до 25-46 часов. По истечении этого времени происходит вымет молоди. Партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 дня. Формирование яиц в кладке прекращается за 2-3 дня до смерти. В природе дафнии живут в среднем 20-25 дней, а в лаборатории при оптимальном режиме 3-4 месяца и более. При температурах свыше 250С продолжительность жизни дафний может сократиться до 25 дней.

Источником питания дафний в природных водоемах являются бактерии, одноклеточные водоросли, детрит, растворенные органические вещества. Интенсивность потребления корма зависит от его характера, концентрации в среде, температуры и возраста рачков. Процесс питания дафний непосредственно связан с движением грудных ножек, направляющих ток воды во внутрь раковины. Пищевые частицы, отфильтрованные на «сите», поступают в продольный желоб и передаются ко рту рачка.

Функции грудных ножек связаны с процессами дыхания. В жабрах (овальные выросты ножек) происходит газообмен. Дафния устойчива к изменению кислородного режима (от 2 мг О2/л), что связано со способностью синтезировать гемоглобин. В условиях пониженной концентрации растворенного кислорода дафнии приобретают красноватый цвет, а при благоприятных условиях – розовато-желтый цвет.

В лабораторных условиях мы использовали дрожжевой корм, который готовили следующим образом: 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливали 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешиваются. Отстаивают 30 минут. Добавляют надосадочную жидкость в сосуды с рачками в количестве 3 мл на 1 л воды.

Подготовка дафний к биотестированию проходила по следующей схеме: 30-40 рачков с выводковыми камерами полными яиц или зародышей на 3-4 суток до тестирования пересаживают в 1-2-хлитровые емкости (стаканы) с аквариумной водой, в которую перед посадкой дафний вносят корм. После появления молоди (каждая самка может выметать от 10 до 40 молодых дафний) взрослых особей удаляют с помощью стеклянной трубки, а одно-двухдневную молодь используют для биотестирования. Необходимое для тестирование количество дафний определяется числом контрольных проб воды и их разбавлений. Так, для тестирования одной пробы с одним повтором, в трехкратной повторности, потребуется 60 дафний (в каждый сосуд для тестирования помещают по 10 рачков)

6. Тесты токсичности на Daphnia

Существуют несколько тестов-методов определения токсичности природных и сточных вод на Daphnia, разработанных разными авторами. Мы пользовались тестом Министерства мелиорации и водного хозяйства СССР 1986 года «Биотестирование сточных вод с использованием Daphnia»

При биотестировании определяют острое и хроническое токсическое воздействие вредных веществ на животных. За острое принимается действие, оказываемое сточной водой на Daphnia в течение от 10 минут до 96 часов и проявляющееся в их обездвижении или гибели. Перед биотестированием проводились подготовительные работы, включающие получение исходного материала для лабораторной культуры и ее выращивания. Для биотестирования отбирали пробу сточной воды из прудов отстойников шести сахарных заводов области. Для сравнения с фоном отбирали пробу воды вне зоны влияния сточных вод.

Пробы помещали в стеклянные емкости, которые заполняли под крышку, чтобы исключить доступ воздуха. Не допускается замораживание и консервирование отобранных проб. Биотестирование проводили сразу после отбора проб и доставки их в лабораторию. Запас воды для биотестирования хранили в холодильнике. Температура тестируемой воды +18-240С.

Биотестирование установившихся сбросов сточных вод производится для выявления и последующего осуществления контроля источников ЭВЗ (экстемально высокого загрязнения). Определяется острое действие тестируемых проб на дафний. Критерием острого токсического действия является выживаемость рачков, показатель выживаемости – количество выживших дафний за период тестирования. Тестируют сточную воду без разбавления и воду контрольную.

По 100 мл аквариумной и соответствующих проб воды наливают в сосуды для тестирования. В каждый помещают по 10 особей молоди дафний. Их вносят в сосуды для тестирования с помощью сачка диаметром 3-4 см из планктонного газа или пипеткой с резиновой грушей. Повторность трехкратная. Сосуды оставляют при рассеянном свете. Дафний в течение всего периода биотестирования не кормят. Подсчитывают количество погибших и обездвиженных дафний, последних включают в число погибших. Обездвиженным считается опустившийся на дно рачок, не поднимающийся в толщу воды через 10-30 секунд после встряхивания сосуда. Определяют количество выживших дафний. Учет проводят каждый час в течение первых 8 часов наблюдений, затем через 12 и 24 часа от начала тестирования, в последующем – в начале и конце рабочего дня.

7. Обработка и оценка результатов

Определяют среднюю арифметическую величину выживаемости дафний в тестируемой воде по сравнению с контролем и высчитывают процент отклонения от контроля. Тестируемая вода оказывает острое токсическое действие на дафний в том случае, если процент отклонения от контрольного показателя выживаемости дафний в течение 96 часов составляет менее 10. Результаты биотестирования выражают в баллах

В случае получения 0 баллов ситуация считается благополучной и не требует применения дополнительных водоохранных мер. При получении оценочного балла 1 ситуация считается неблагополучной и принимаются меры по улучшению работы имеющихся водоохранных сооружений. При оценочном балле 2 необходимо провести биотестирование соответсвующих проб воды для определения хронического токсического действия. Результаты биотестирования, выражающиеся в баллах 3,4,5 свидетельствуют о ситуации, которая может нанести существенный ущерб водному объекту и требуют принятия мер по организации дополнительных водоохранных мероприятий. Предприятия, на которых тестируемые пробы воды из контрольного створа водного объекта оценены баллом 3 и выше, включаются в перечень потенциальных источников ЭВЗ водных объектов и подлежат токсикологическому контролю

8. Выводы и предложения

В результате проведенных анализов были получены следующие результаты:

Без разбавления: Два сахарных завода (Эртильский и Грибановский) проводят сброс гипертоксических вод (5 баллов) в пруды-отстойники. Садовский сахарный завод проводит сброс высокотоксичных вод (4 балла), а три сахарных завода (Елань-Коленовский, Нижнее-Кисляйский и Перелешинский) проводят сброс среднетоксичных вод (3 балла) в пруды-отстойники.

При разбавлении 1:10: токсичность с гипертоксичной снижается до высокотоксичной.

При разбавлении 1:100: Гипертоксичность снижается, вода становится среднетоксичной.

Данные экспериментов были переданы в Областной Комитет по экологии и охране природных ресурсов. Все заводы занесены в перечень потенциальных источников ЭВЗ ввозных объектов и подлежат токсикологическому контролю.

Проведенная работа показала, что методика биотестирования проста и доступна. Ее можно рекомендовать для широкого применения в практике как специалистам гидробиологам природоохранных организаций и вузов, так и студентам вузов, техникумов и учащимся технических училищ и школ.

Биотестирование ныне является основным приемом в разработке ПДК химических веществ в воде. При этом определяют такие параметры, характеризующие токсичность, как: ЛК50 (летальная концентрация для 50% тест-организмов), ЭК50 (эффективная концентрация для 50% тест-организмов), МНК (максимально недействующая концентрация), ОБУВ (ориентировочно безопасный уровень воздействия), ОТД (острое токсическое действие), ХТД (хроническое токсическое действие) и ЛВ50 (время гибели 50% тест - организмов).[ ...]

Биотестирование водоемов основано на том, что отдельные группы гидробионтов могут жить при определенной степени загрязнения водоема органическими веществами. Способность гидробионтов выживать в загрязненной органикой среде называется сапробностъю.[ ...]

Биотестирование проведено также с использованием клеточного тест-объекта - гранулированной спермы быка, т.е. путем анализа зависимости показателя подвижности суспензии сперматазоидов от времени и определения степени подавления их подвижности (сокращения среднего времени подвижности) под воздействием содержащихся в воде токсикантов, в соответствии с . Реализация метода осуществляется с применением автоматической аналитической системы, обеспечивающей сравнительную оценку показателя подвижности суспензии сперматозоидов в опытных пробах воды и в контрольных средах, определение процедур расчетов и выдачу результатов в виде соответствующих индексов токсичности. Оценка показателя подвижности осуществляется путем автоматического подсчета числа флуктуации интенсивности рассеянного излучения, вызванного прохождением клеток через оптический зонд.[ ...]

Биотестирование сточных вод, идущих на повторное использование, показало, что сточная вода в неочищенном виде подавляет прорастание семян и рост проростков на 22%, после очистных сооружений - на 12%, а разбавленная в соотношении 1:1 или 1:2 - на 9%. Контроль во всех случаях - отстоянная водопроводная вода.[ ...]

БИОТЕСТИРОВАНИЕ - оценка состояния окружающей среды по живым организмам. См. Биологические индикаторы. БИОТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СРЕДЫ (Б.т.с.) - изменение абиотических условий под влиянием жизнедеятельности организмов. В.И. Вернадский рассматривал живые организмы как геохимический фактор, который создал биосферу. Благодаря живым организмам в атмосфере появился кислород, сформировались почвы, образовались толщи осадочных пород на дне океанов. В результате Б.т.с. создаются запасы детрита в виде торфа и сапропеля.[ ...]

Для биотестирования используются самые различные организмы (водные растения, водоросли, ракообразные, моллюски и рыбы). Однако наиболее чувствительным к загрязняющим веществам различной природы является пресноводный рачок дафния магна.[ ...]

Под биотестированием понимают приемы исследования, с помощью которых о качестве среды, факторах, действующих самостоятельно или в сочетании с другими, судят о выживаемости, состоянию и поведению специально помещенных в эту среду организмов - тест-обьектов. Рост особей, их продуктивность, выживаемость служат показателями для биотестирования качества среды. Для целей мониторинга природных и сточных вод предприятий оказались удобными фитопланктон и дафнии.[ ...]

Методы биотестирования основаны на оценке физиологического состояния и адаптационного стресса организмов, адаптированных к чистой среде и на время эксперимента помещенных в испытуемую среду. Эти методы также дают информацию об интегральном экологическом качестве среды. Цели прогноза обычно связаны с экстраполяцией результатов опытов на качество жизни человека и на изменения показателей биоразнообразия в экосистемах. Оценка среды по системе биотестирования и биоиндикации в каждой точке территории должна базироваться на анализе комплекса видов. Для наземных экосистем -это травянистые и древесные растения, беспозвоночные животные (например, моллюски и членистоногие) и позвоночные животные (земноводные, рептилии, птицы, млекопитающие). Оценка состояния каждого вида базируется на результатах использования системы методов: морфологических (например, регистрации признаков асимметрии внешнего строения), генетических (тесты на мутагенную активность), физиологических (тесты на интенсивность энергетического обмена), биохимических (оценка окислительного стресса у животных и фотосинтеза у растений), иммунологических (тесты на иммунную потенцию).[ ...]

Длительное биотестирование (3=20 сут.) позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее число исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости -среднее число молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости и плодовитости дафний.[ ...]

Субстрат для биотестирования собран в районе Среднеуральского медеплавильного завода (Свердловская обл., г. Ревда, Средний Урал, южная тайга). Главные ингредиенты выбросов - 802 и полиметаллическая пыль (в основном соединения Си, РЬ, Cd, 2п, Аь). Многолетнее загрязнение (начиная с 1940 г.) привело к значительному подкислению лесной подстилки и увеличению содержания в ней металлов (табл. 1). Закономерности техногенной трансформации лесных экосистем района исследований описаны ранее (Воробейчик и др., 1994).[ ...]

Таким образом, биотестирование воды представляет собой оценку качества воды по ответным реакциям водных организмов, которые являются в этих случаях тест - объектами (табл. 15.2).[ ...]

К достоинствам биотестирования можно отнести также возможность его использования с помощью портативных приборов при полевых исследованиях, а также простоту сбора и анализа проб. Так, с помощью этих методов по функциональному состоянию (поведению) тест - объектов (ракообразные - дафнии, водоросли - хлорелла, рыбы - гуппии и др.) можно оценивать качество вод и осуществлять ранжирование их по классам состояний. Таким образом появляется возможность использования этих вод для питьевых или иных целей. Наиболее информативные критерии оценки состояния поверхностных и сточных вод (по состоянию тест - объектов) приведены в табл. 42.[ ...]

Удачно дополняет метод биотестирования на дафниях биоте-стовый анализ с помощью простейших микроорганизмов - инфузорий-туфелек (Paramecium caudatum). Метод биотестового анализа водных проб основан на способности инфузорий избегать неблагоприятных и опасных для жизнедеятельности зон и активно перемещаться по градиентам концентраций химических веществ в благоприятные зоны. Метод позволяет оперативно определять острую токсичность водных проб и предназначен для контроля токсичности природных, сточных, питьевых вод, водных вытяжек из различных материалов и пищевых продуктов.[ ...]

Методические указания по биотестированию сточных вод с использованием рачка дафния магна. - М.: в/о Союзводпроект ОМПР и ВП, 1986. - 27 с.[ ...]

При использовании методов биотестирования оперируют рядом понятий и определений: под тест-объектом понимают живой организм, используемый в биотестировании; тест-реакция - изменение какого-либо показателя тест-объекта под воздействием токсичных веществ, содержащихся в воде; тест-параметр - количественное выражение тест-реакции; критерий токсичности -значение тест-параметра или правило, на основании которого делают вывод о токсичности воды.[ ...]

Особенно перспективными в биотестировании окружающей среды являются простейшие - инфузории. Их используют в экотоксикологическом тестировании вод и почв, в биотестировании химических веществ и материалов биологического происхождения.[ ...]

Методическое руководство по биотестированию включает методики определения токсичности с использованием в качестве тест-объектов дафний, водорослей и рыб. Помимо обязательных тестов (на дафниях) допускается использование других рекомендованных методов биотестирования.[ ...]

В табл. 21 представлены результаты биотестирования пяти рецептур антисептика, содержащего алкил бензил аммонийхлорид (¿)), тринатрийфосфат (к2), карбонат натрия (к3) и борную кислоту (¿4).[ ...]

Гудимов A.B., Петров B.C., Гудимова Е.Н. Биотестирование на донных беспозвоночных как средство предупреждения и минимизации загрязнения акваторий в районах разработки месторождений нефти и газа на шельфе Арктики// Морские и арктические нефтегазовые месторождения и экология. М.: ВНИИГАЗ, 1996.[ ...]

В качестве критерия токсичности речных вод использовали выживаемость тестируемых организмов.[ ...]

На практике для контроля токсичности воды наряду с известными методами биотестирования широко применяют биохимико-физиологи-ческие испытания, основанные на сравнении параметров, характеризующих нормальное поведение организма или биокультуры, с теми же параметрами, наблюдаемыми под воздействием загрязненной воды . Как правило, контролируемыми параметрами являются изменение концентрации органического кислорода, количество поглощенного кислорода или выделившегося углекислого газа и др. Все эти методики впервые стандартизуются сразу на международном уровне.[ ...]

Другой возможностью интегральной оценки уровня загрязнения атмосферы является биотестирование токсичности вод снежного покрова города, накопившего в себе за зимний период выбросы промышленных предприятий и автотранспорта. Для этих целей нами разработаны и аттестованы оперативная методика и комплект аппаратуры для биотестирования вод по воздействию загрязнителей на рост водоросли хлореллы. Эта разработка позволяет одновременно оценивать токсичность многих проб талого снега, а также других природных и сточных вод. Проведенные исследования показали высокую эффективность данного методического подхода в определении загрязнения окружающей среды.[ ...]

На основе результатов экспериментальных исследований предлагается использовать биотестирование как метод прогнозной оценки загрязнения акваториальных вод при освоении морских нефтегазовых месторождений. Изложены преимущества рассматриваемого метода по сравнению с общепринятой системой мониторинга.[ ...]

Нами развиты, доработаны и адаптированы к производственным условиям экспресс-методы биотестирования водных объектов с помощью таких тест-организмов, как ракообразные -Daphnia magna Straus (cladocera, crustacea), далее для краткости -Daphnia magna, а также простейшие - Paramecium caudatum (рис. 3.4).[ ...]

Для оценки биологической значимости выявленных изменений структурных особенностей воды проводили ее биотестирование в соответствии с рекомендациями «Методы биотестирования вод» . Использовали гид-робионты различных трофических уровней (3-х систематических групп): простейшие - инфузории Tetrahimena pyriformis, беспозвоночные - пресноводный рачок Daphnia magna и рыбы-мальки гуппи Poecilia reticulata peters.[ ...]

В настоящее время наиболее информативным и достоверным методом оценки качества ОПС и поступающих в нее веществ является биотестирование. В бурении этим способом проводится оценка токсичности промывочных жидкостей и технологических отходов бурения. Следует отметить, что биотестирование буровых сточных вод (БСВ) выполняется корректно, по утвержденной методике для сточных вод. Однако для бурового шлама и буровых технологических жидкостей, по составу и свойствам существенно отличающихся от БСВ, научно обоснованной методики биотестирования, которая учитывала бы их специфику, нет. Поэтому условия проведения исследований, например, кратность разбавления исходного вещества, не унифицированы. Соответственно, результаты исследований разных авторов зачастую несопоставимы, а в ряде случаев их достоверность сомнительна. Так, при разбавлении промывочных жидкостей их дисперсная фаза выпадает в осадок и ее токсикологический эффект фактически не учитывается. Между тем используемая в составе БПЖ глина обладает высокой адсорбирующей способностью. Поэтому в водную среду попадает не исходная глина, использованная для приготовления промывочной жидкости, а модифицированная в процессе циркуляции через скважину. Кроме того, в БПЖ попадают глинистые частицы из выбуренной породы.[ ...]

К сожалению, при использовании приведенных оценочных шкал необходимо учитывать методический аспект. Известно, что результаты биотестирования очень зависят от методики определения. И даже малейшие отклонения, незаметные для неопытного экспериментатора, приводят к значительному искажению результата.[ ...]

На протяжении ряда последних лет сформировалось самостоятельное направление биологического контроля состояния среды путем биоиндикации и биотестирования [Захаров, 1993; Шуберт (ред.), 1988; Мелехова и др., 1988, 2000; Смуров, 2000].[ ...]

3

Одним из методов интегральной оценки качества воды, имеющей контакт с устройством очистки, для выявления возможного негативного влияния конструкционных материалов на качество питьевой воды является биотестирование с помощью гидробионтов различных трофических уровней.[ ...]

Организмы донной фауны являются не только удобными объектами для акваториального содержания, но и прекрасными мониторами хроничекого загрязнения. Анализ их физиологических и поведенческих реакций при биотестировании позволяет достоверно определить пороговые, переносимые и летальные нагрузки, вызываемые тем или иным видом загрязнения. Биотесгирование на Мурмане пока еще не получило должного развития, хотя насущность его очевидна, а результаты нельзя заменить мониторингом. Начавшиеся в нашем институте исследования по биотестированию буровых растворов и их компонентов показали его успешность, в частности, на таких объектах, как голотурия Cucumaria frondosa, гидроид Dynamena pumita, амфипода Gammarus oceanicus, двустворки - мидия (Mytilus edulis L.) и Modiolus (рис. 1-3). Эксперименты показали, что моллюски-фильтраторы, прекрасно адаптирующиеся к лабораторным условиям, сочетают в себе одновременно высокую общую резистентность при достаточной чувствительности отдельных физиологических и поведенческих реакций по отношению к различного рода загрязнениям. Кроме того, по поведенческим актам и росту мидий, например, можно осуществлять не только тестирование загрязнителей, но и проводить непрерывный контроль за качеством природных вод, особенно в прибрежье (губа Териберка, Кольский залив), - в местах выхода подводных трубопроводов и перетранспортировки газоконденсата, нефти и газа.[ ...]

Дафния магна - мелкое ракообразное, постоянный обитатель стоячих и слабопроточных водоемов. По способу питания - активный фильтратор, размер самок достигает 3 мм, самцы в 1,5-2 раза меньше. Дафнии используются для биотестирования водоемов.[ ...]

Разработанная методика позволит осуществлять анализ фактической экологической опасности веществ. При этом процедура анализа экологического риска нетоварных веществ будет основана на сопоставлении измеренного показателя биотестирования со шкалой уровня техногенного воздействия. Таким образом, вместо утверждаемых в настоящее время эколого-рыбохозяйственных нормативов для всех используемых нетоварных веществ необходимо утвердить только методику биотестирования и несколько шкал уровня техногенного воздействия на окружающую природную среду.[ ...]

Во Франции оценка качества водной среды по токсикологическим показателям является обязательной в “Системе контроля качества пресных вод”. Производственный токсикологический контроль сточных вод проводят более чем на 150 предприятиях. Для биотестирования применяют стандартный набор биотестов на острую токсичность с использованием бактерий, водорослей, дафний и рыб.[ ...]

При обсуждении результатов биотестового анализа водных объектов возникает вопрос о критерии токсичности, т.е. о выборе значений индекса токсичности, при которых вода оказывает или не оказывает токсическое воздействие на живые организмы. Методы биотестирования апробированы нами на модельных растворах с известным содержанием токсичных веществ и реальных водных объектах .[ ...]

Величины ДФ или АФ/Фт, полученные при построении световых кривых, характеризуют удельную фотосинтетическую и общую физиологическую активность водорослей и могут использоваться в качестве самостоятельного показателя их состояния, в частности при биоиндикации и биотестирования качества воды.[ ...]

Современное загрязнение почти всегда подразумевает наличие в окружающей среде целого комплекса факторов, совместное действие которых может приводить к неожиданным эффектам. Так, специалисты в области экотоксикологии отмечают факты несогласованности результатов биотестирования (токсичность) и химического анализа («благополучные» данные). В качестве одной из возможных причин могут быть комбинированные эффекты. В частности, было обнаружено, что накопление в почве мышьяка приводит к возникновению специфических микробных сообществ. Химическое загрязнение стимулирует развитие фитопатогенных микроорганизмов. Например, при повышенной концентрации мышьяка формируются фузариозно-нематодные комплексы, представляющие двойную опасность для высших растений (Вараксина и др., 2004).[ ...]

При создании новых рецептур многокомпонентных антисептиков на основе явления синергизма главной задачей является подбор оптимального соотношения составных ингредиентов. Рецептуры антисептиков с улучшенными эксплуатационными и экологическими свойствами создают на основе биотестирования по методике "Лаборатории защиты древесины ЦНИИМОД" , описанной выше (1).[ ...]

Под биотестом понимают оценку (испытание) в строго определенных условиях действия вещества или комплекса веществ на водные организмы путем регистрации изменений того или иного биологического (или физиолого-биохимического) показателя исследуемого объекта, сравниваемого с контрольным. Подопытные организмы именуются тест-объектами (тест-организмами), а процесс проведения испытаний-биотестированием .[ ...]

Весьма информативными при экологических оценках водных экосистем являются характеристики состояния и развития всех экологических групп водного сообщества. При выделении зон чрезвычайной экологической ситуации и экологического бедствия используются показатели по бактериопланкто-ну, фитопланктону, зоопланктону и ихтиофауне. Определение степени токсичности вод проводится также на основе биотестирования преимущественно на низших ракообразных. При этом уровень токсичности водной массы должен определяться на всех основных фазах гидрологического цикла. Параметры предложенных показателей должны наблюдаться на данной территории постоянно на протяжении достаточно длительного времени с минимальным периодом не менее 3 лет.[ ...]

Приводятся данные по изменению физико-химических свойств буровых растворов в забойных условиях. Показано, что прогнозирование токсичности отходов бурения при бурении скважин становится невозможным. На примере многочисленных экологических исследований отходов бурения установлено, что наиболее уязвимым звеном экосистемы рыбохозяйственного водоема являются дафнии. В связи с этим обосновывается целесообразность применения метода биотестирования буровых растворов на стадии разработки и отходов бурения в процессе строительства скважин.[ ...]

Между тем многие из перечисленных трудностей удается преодолеть, если в традиционную схему экологического контроля ввести методы биомониторинга. Эти методы основаны на регистрации суммарного токсического действия на специальные тест-организмы сразу всех или многих из компонентов загрязнения и, таким образом, позволяют быстро и с минимальными затратами оценить, является ли анализируемая проба загрязненной или нет. После достаточно масштабной, но малозатратной процедуры биотестирования дорогостоящему химическому анализу подвергаются лишь те образцы, которые вызывают сомнения относительно их экологической безопасности. Биоиндикационный анализ качества среды, основанный на определении состояния организмов, живущих на обследуемой территории, позволяет оценить воздействие на них всех загрязнителей в течение длительного времени, что дает возможность получить интегральный показатель уровня загрязнения среды. К сожалению, из-за недостаточной научно-методической, технической и нормативно-правовой проработки биологические методы пока лишь ограниченно используются в системе экологического мониторинга.[ ...]

Индикационные критерии оценки. В последние годы б ио индикация получила достаточно широкое распространение при оценках качества поверхностных вод. Она по функциональному состоянию (поведению) тест-объектов (ракообразные - дафнии, водоросли - хлорелла, рыбы - гуппи) позволяет ранжировать воды по классам состояний (нормы, риска, кризиса, бедствия) и, по существу, дает интегральную оценку их качества и определяет возможность использования воды для питьевых целей. Лимитирующим фактором использования метода биотестирования является продолжительный срок проведения анализа (не менее 96 ч) и отсутствие информации о химическом составе воды. Пример использования биотестов для определения качества воды приводится в табл. 21.[ ...]

В качестве биотеста можно использовать одинаковые проростки гороха, фасоли, которые отбирают из партии после их прорастания. У горошин срезают половинки обеих семядолей, чтобы у них было ровное ложе. Фильтровальную бумагу, лежащую на дне химического стакана емкостью 200-250 мл смачивают 5 мл опытного раствора, на дно помещают по 5 подготовленных горошин, закрывают крышкой от чашки Петри. После того, как горошины вырастут на высоту 5-7 см и более (до крышки стакана), производят их измерение. Контроль - горошины на дистиллированной воде. Подсчет проводится так же, как и при биотестировании по прорастанию семян.[ ...]

В целях определения экологического состояния водоемов используют результаты гидробиологических наблюдений, которые дают наиболее полную информацию. Биоиндикация загрязнения водоемов включает большой набор показателей, охватывающих основные трофические уровни водной экосистемы: фитопланктон, зоопланктон, бентос и другие. При этом суммирующими (интегральными) показателями, которые способны охарактеризовать общий уровень загрязнения вод всем комплексом токсичных веществ и, следовательно, опасность водной среды для гидробионтов, являются битестовые (токсикологические) показатели. Соответствующий токсикологический анализ проводится с помощью приемов и методов биотестирования токсичности.[ ...]

К этой же группе методов следует отнести мониторинг - периодическое или непрерывное слежение за состоянием экологических объектов и за качеством среды. Большое практическое значение имеет регистрация состава и количества вредных примесей в воде, воздухе, почве, растениях в зонах антропогенного загрязнения, а также исследования переноса загрязнителей в разных средах. В настоящее время техника экологического мониторинга быстро развивается, используя новейшие методы физико-химического экспресс-анализа, дистанционного зондирования, телеметрии и компьютерной обработки данных. Важным средством экологического мониторинга, позволяющим получить интегральную оценку качества среды, являются биоиндикация и биотестирование - использование для контроля состояния среды некоторых организмов, особо чувствительных к изменениям среды и к появлению в ней вредных примесей.[ ...]

Оценена пространственная вариабельность (в пределах участка 100x100 м) загрязненности лесной подстилки тяжелыми металлами (Си, Сё, РЬ, 2п), ее кислотности и фитотоксичности (по корневому тесту на проростках из генетически однородной выборки одуванчика лекарственного). Подстилка собрана в трех зонах с разным уровнем токсической нагрузки на территории, подверженной многолетнему полиметаллическому загрязнению выбросами медеплавильного завода на Среднем Урале. Разброс фитотоксичности максимален на участке со средним уровнем загрязнения, где отмечены как очень высокие, так и очень низкие значения, что приводит к возникновению существенной нелинейности в дозовой зависимости. Фитотоксичность подстилки в первую очередь определяют обменные формы металлов. Обнаружен резко выраженный антагонизм между тяжелыми металлами и кислотностью при биотестировании образцов с максимально загрязненного участка.[ ...]

В связи с этим представляют интерес результаты исследований по ряду ключевых вопросов безопасного обращения с веществами и материалами в бурении. В общем случае используемые и образующиеся в бурении вещества можно разделить на две категории - товарные (промышленная продукция) и нетоварные (буровые технологические жидкости и технологические отходы бурения и испытания скважины). Принципиальные отличия между этими категориями веществ являются веским основанием для того, чтобы по-разному подходить к оценке их экологичности. Однако в нормативных документах федерального уровня эта специфика не учитывается и предусматривается единый подход к оценке экологической опасности веществ путем определения значения их предельно допустимой концентрации в компонентах окружающей природной среды. Применительно к нетоварным веществам целесообразно перейти от нормирования содержания вещества в окружающей среде к нормированию его воздействия. Эта задача может быть решена путем комплексного биотестирования нетоварных веществ. В целях отработки методики таких исследований проведено изучение отработанного бурового раствора и шлама с использованием различных тест-объектов, результаты которого изложены в настоящем обзоре.

Теперь перейдем к решению проблемы выбора подходящего тест-организма. А заодно и составим представление об общей токсичности воды в аквариуме.

Оказывается можно оценить общую токсичность воды в аквариуме просто понаблюдав за улитками.

Сама по себе это очень простая и не плохая идея - посадить какой-нибудь живущий в воде организм в испытуемую пробу и посмотреть, что с ним будет. А затем решить хороша ли эта вода или плоха? Реализовать такую идею - значит провести биотест. Осталось только ответить на 2 вопроса:
1. Какой организм ( он будет называться тест-организмом) выбрать?

2. Что собственно с ним должно произойти, или на основании каких явлений можно судить о токсичности ?

Однако, если теоретические основы биотестирования вас не волнуют, и вы просто хотите узнать, как с помощью улиток ампулярий можно определить токсичность воды, то можно пропустить часть изложенного ниже материала и сразу перейти к .

Какой тест организм выбрать?

К настоящему времени предложено некоторое количество тест-организмов . (Тест-организм - это и есть то несчастное существо, по реакциям которого мы будем судить о токсичности воды). Разработаны строгие, официально принятые министерством Природных Ресурсов Российской Федерации биотесты. Наиболее популярными тест-организмами оказались дафнии и инфузории. Тесты построены на количественной оценке их смерности. По количеству умерших делается вывод о токсичности. Казалось бы, все это понятно, легко и просто, но на практике оказалось не очень-то информативно. Если подопытные мрут, то понятно, что вода оказывает токсическое действие, но есть ли разница в степени токсичности, когда в одном случае , к примеру, умерло 40% дафний, а в другом 60%? Ну, вроде бы там где 60% - вода токсичнее, но ведь и 40% цифра немалая. Может просто группы тест-организмов были не слишком однородны в плане устойчивости отдельных особей к вредным воздействиям, отсюда и разница в проценте смертности, а токсичность проб одинакова?
В общем вопрос статистической достоверности результатов биотестирования сразу же выходит на первый план. Верить или не верить результатам биотестирования во многом зависит именно от статистической корректности постановки эксперимента. Но не только. В не меньшей степени многое зависит и от выбора самого тест-организма, как биологического вида. Тут нельзя не учитывать особенности его биологии и физиологии. Возьмем опять ту же дафнию. Где она живет в природе? Ну, прямо скажем, не в очень-то чистых водоёмах. Аквариумисты-рыбоводы ездят ее ловить на отстойники водоочистных сооружений. Дискусы (да и не только они) жить в такой воде не станут, а мы не будем пить такую воду - запах и вкус не понравятся. Но дафнии там живут и бурно размножаются, инфузории тоже. Так можно ли на основании их реакций судить о токсичности воды применительно к нам с вами (людям то есть) и аквариумным рыбкам? Сильно подозреваю, что все же нельзя, как бы многие авторы ни пытались доказать обратное. Я не буду далее углубляться в научные и наукообразные дебри споров вокруг биотестирования, а приступлю к описанию того тест-организма, который мы с вами будем использовать в биотесте.
Итак, мы будем оценивать токсичность воды по поведению (именно в первую очередь по поведению , не по смертности) улиток ампулярий. О самих этих улитках можно прочитать . Чем замечательны ампулярии? Да целым рядом важных особенностей!

1. Улитки ампулярии теплолюбивы и обладают высоким уровнем обмена веществ.

При температуре воды 25-30°С, биохимические реакции в организме ампулярий идут замечательно быстро. Они много едят, много гадят и энергично растут. А это означает, что наличие токсических веществ в воде быстро окажет влияние на обменные процессы в их организме и это будет видно. Ведь суть действия токсических веществ в том и состоит, что они нарушают нормальный ход биохимических реакций. Токсическое воздействие можно будет обнаружить быстро. Под словом "быстро" подразумевается срок от нескольких часов до двух суток.

Фото 1. Перед вами молодые улитки ампулярии. В качестве тест-организмов они хороши благодаря интенсивному обмену веществ. Фотография наглядно демонстрирует этот тезис. Стрелочкой показаны выросты мантии, выходящие за края раковины. Возможно они увеличивают площадь контакта мантии с водой и облегчают кожное дыхание. А возможно они как-то связаны с быстрым ростом края раковины. Во всяком случае, когда эти выступы хорошо заметны у молодых улиток, последние увеличиваются в размерах чрезвычайно быстро.

2. Высокая чувствительность и одновременно резистентность ампулярий к токсическим воздействиям.

Ампулярии обладают двумя важными для тест-организма качествами. Они чувствительны к действию токсических веществ (почему, я объяснил пунктом выше), и одновременно резистентны (устойчивы) к ним (только соли меди убивают их уже в невысоких концентрациях). Резистентны - это значит, что не мрут сразу. Кстати именно поэтому они очень хороши при запуске аквариума в качестве "животных-первопроходцев". При токсическом воздействии на организм они начинают меньше есть, медленнее ползать, нуждаться в большем или, наоборот, меньшем количестве кислорода, запираться в своей раковине крышечкой, отгораживаясь от вредного действия грязной воды. То есть поведение отравленных улиток отличается от поведения нормальных. Улитки включают все свои защитные механизмы, отвечая стрессовой реакцией на наличие токсического вещества в воде и долго остаются живыми, либо даже приспосабливаются к постоянному присутствию яда в воде (см. также токсичность ). Все это можно зарегистрировать и на основании этих поведенческих реакций судить о токсичности. Ну, а когда улиткам станет совсем плохо (это случается при превышении предельно допустимых концентраций в воде в 20-100 раз или даже более) - они умирают. Таким образом нарушения в поведении ампулярий можно обнаружить уже при очень низких содержаниях токсических веществ в воде (примерно 0.01-0.1 от предельно допустимой концентрации), а умирают эти улитки только при многократных передозировках. Это означает, что биотест с их использованием будет работать в очень широком диапазоне токсичности. Важность этого обстоятельства можно пояснить на следующем примере. Главный недостаток теста на дафниях - это очень узкий диапазон. Они живут без заметных отклонений от нормы даже при значительных концентрациях токсического вещества (несколько ПДК, о том, что это такое написано в первой статье про биотестирование ), не выявляя его, но сразу умирают при совсем незначительном дальнейшем повышении его концентрации.

3. Высокий уровень организации ампулярий.

Ампулярии довольно сложноорганизованные существа (в отличие от, например, инфузорий). Они обладают практически теми же анатомо-физиологическими системами, что и мы с вами: нервной, двигательной, пищеварительной, выделительной, дыхательной, половой, гуморальной (системой гормональной регуляции функций организма). Их организм в ответ на различные вредоносные внешнее воздействия отвечает неспецифической стрессовой реакцией с участием всех систем. На основании этой реакции можно судить об общей токсичности воды, которая может определяться не каким-то одним токсическим веществом, а суммарным действием многих имеющихся в воде загрязнителей.

4. Поведение ампулярий включает в себя разнообразные поведенческие реакции.

Как я уже писал, поведение ампулярий достаточно разнообразно. Это позволяет судить о токсичности среды их обитания по отклонению этих поведенческих реакций от нормы.

Video is not visible, most likely your browser does not support HTML5 video

У ампулярий есть и легкие, и жабры. В воде, окисляемость которой невелика, кислорода много и улитки дышат в основном при помощи жабры. На поверхность для вентиляции легких поднимаются редко - не чаще чем один раз в 5-10 минут, а то и реже, сохраняя при этом высокую двигательную активность. В хороших условиях ампулярии довольно подвижны и могут буквально "летать" по аквариуму, особенно если они голодны. Если моллюск попадает в токсичную среду, то его организм отвечает на это генерализованной стрессовой реакцией. В первые часы потребность улитки в кислороде резко возрастает. Она все чаще начинает подниматься к поверхности за свежим воздухом. Иной раз интервалы между отдельными "проветриваниями" легких начинают составлять лишь несколько десятков секунд. В отдельных случаях моллюск так и остается у поверхности выставив сифон наружу. А двигательная активность улитки заметно падает: она меньше ползает и ползает медленнее обычного. Такие симптомы наблюдаются, например, при попадании в воду поверхностно активных веществ (моющие средства).
Аквариумисту бывает не вредно периодически присматриваться, как там дела с дыхательной и двигательной активностью его ампулярий? Если после подмены воды в аквариуме дыхательная активность вдруг резко возросла, то есть повод встревожиться и измерить содержание в воде аммиака и нитритов . Эти вещества тоже могут вызывать повышение дыхательной активности. А может быть вы вспомните, что мыли с мылом грот, а потом не очень тщательно его прополоскали под сильной струей воды?
При все продолжающемся токсическом воздействии обмен веществ улитки начинает замедляться. Она очень мало или очень медленно ползает, ее тело почти полностью втянуто в раковину и она не вентилирует лёгкие часами - такие наблюдения должны вызвать у аквариумиста особую тревогу. В наиболее тяжелых случаях улитки лежат на дне или плавают у поверхности с закрытой крышечкой раковиной. Для лучшей изоляции от токсического воздействия внешней среды улитка может выделить изрядное количество слизи, изолирующей щель между раковиной и крышечкой. Когда моллюск умирает, крышечка приоткрывается и тело моллюска вываливается наружу. Это вводит в заблуждение неопытных аквариумистов. Они думают,что улитки живые. На самом деле уж скорее еще жива улитка с плотно закрытой раковиной, чем с сильно приоткрытой.

Если вы кормите рыбок плавающим кормом, то и улитки, если, конечно, они хорошо себя чувствуют, стремятся поучаствовать в общем пиршестве. Плавающий корм они собирают с помощью показанных выше воронок. Но вот если ампулярии упорно поднимаются к поверхности и образуют воронки, хотя кормления не было, то это должно насторожить. Как правило, это говорит о слишком высоком содержании в воде растворенных органических веществ, которые улитки чувствуют по запаху и вкусу (соответствующие рецепторы расположены на усах и губных щупальцах). Учуяв запах яств, положение которых локализовать невозможно (запах повсюду), ампулярии справедливо полагают, что они рассеяны по поверхности воды и ползут делать воронки дабы их собрать.
На эту особенность улиточного поведения надо обращать внимание при тестировании воды из дачных колодцев. Высокое содержание органики в них не редкость. Оказавшись в такой воде улитки собираются у поверхности и складывают ногу в воронку. Тут сразу понятно, что тестируемая вода не слишком хороша. В аквариуме с помощью этой поведенческой реакции улитки собирают с поверхности воды бактериальную пленку и остатки корма. Это очень полезная деятельность. Но задайтесь вопросом, почему эта пленка упорно появляются вновь? Быть может вы слишком много кормите рыб , или недостаточна фильтрация с аэрацией ?

Я рассказал о двух поведенческих реакциях ампулярий, позволяющих сделать некоторые выводы относительно качества воды. Но это еще не биотестирование как таковое. Биотест - это заранее спланированный опыт поставленный в соответствии с разработанным для данного метода биотестирования регламентом, который позволяет получить статистически достоверные результаты. О таком методе будет рассказано в продолжении. Но об этих поведенческих реакциях я упомянул не зря. В практическом плане они сами по себе достаточно информативны. Кроме того, улитки нередко демонстрируют их и по ходу проведения биотеста и экспериментатору полезно понимать, что происходит.
А в завершении этого материала, остановимся на еще одной особенности ампулярий. Как я уже говорил, молодые улитки очень быстро строят свою раковину. Этот процесс нарушается при сильном токсическом воздействии воды. Посмотрим на фотографию в самом начале статьи. Раковина этой бедной улитки разрезана глубокой продольной щелью. Это очень характерное нарушение формирования раковины. Если у ваших улиток то же самое - знайте, что жить в вашем аквариуме очень и очень трудно. Отрицательное воздействие среды на организм таково, что оно уже не может быть скомпенсировано защитными реакциями организма и приводит к морфологическим нарушениям. Благодаря высокой резистентности ампулярия живет, но дается ей это нелегко. В аквариумах, где живут улитки с такими раковинами часто наблюдается "беспричинная" гибель рыб. Кроме того, рыбы часто болеют .

Если своевременно (когда еще продольная щель не слишком велика) улучшить условия существования в аквариуме: не применять по любому поводу, а то и без повода лекарства, содержащие медь и формалин, наладить биофильтрацию и почаще менять воду, то ампулярия успешно восстанавливает целостность раковины. Но рубец останется навсегда как память о пережитых некогда тяжелых временах.

Подробно о конкретной методике биотестирования можно прочитать в статье Биотестирование в домашних условиях, часть II (методика биотеста) .

Владимир Ковалев

Обновлено 11 04 2017

ЦОС ПВ Р 005-95

Документ разработан авторским коллективом в составе: Рахманин Ю.А., Ческис А.Б. (руководители разработки), Еськов А.П., Кирьянова Л.А., Михайлова Р.И., Плитман С.И., Роговец А.И., Тулакина Н.В., Русанова Н.А., Донерьян Л.Г., Пожаров А.В.

В приложениях использованы материалы Методического руководства по биотестированию воды РД 118-02-90* и методических документов по применению прибора "БИОТЕСТЕР", а также "Методики контроля токсичности медицинских изделий однократного применения, стерилизованных радиационным или газовым методом" (МЗ СССР, 1991 г.).

________________
* Документ, упомянутый здесь и далее по тексту, не приводится. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке

Представлен: Техническим комитетом по стандартизации ТК-343 "Качество воды"

Внесён: Управлением стандартизации и сертификации пищевой, лёгкой промышленности и сельскохозяйственного производства Госстандарта России

Утверждён: Заместителем Председателя Госстандарта России 12.10.95 г. для издания и распространения в качестве методического справочного пособия.

Зарегистрирован: Центральным органом по сертификации питьевой воды, материалов, технологических процессов и оборудования, применяемых в хозяйственно-питьевом водоснабжении N ЦОС ПВ Р 005-95

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

В условиях постоянно нарастающего антропогенного загрязнения источников водоснабжения обеспечение безопасности и безвредности питьевой воды, поставляемой населению предприятиями водоснабжения, в значительной мере зависит от полноты, достоверности и оперативности контроля качества воды во всех технологических звеньях системы: в контрольных створах водных объектов, в местах водозаборов, в ёмкостях чистой воды после ее очистки и обеззараживания, в распределительной водопроводной сети у потребителей. При этом число нормируемых и контролируемых параметров качества, в совокупности определяющих безопасность и безвредность воды, увеличилось за последнее десятилетие более, чем в два раза и в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) включает более 100 нормативов. Высокая токсичность и соответственно низкие значения предельно-допустимых концентраций (ПДК) для ряда тяжелых металлов и большинства органических токсикантов существенно усложняют процедуры аналитического химического контроля, требуют продолжительного времени и весьма значительных материальных затрат на проведение комплексного контроля качества воды. Кроме того, проведение даже полного анализа качества воды по всем установленным в нормативных документах индивидуальным показателям не дает возможность определить их комплексное воздействие на организм человека, а принятие системы суммирования относительных концентраций не отражает в полной мере механизм совокупного воздействия токсикантов на степень опасности потребляемой человеком воды.

В связи с этим наряду с традиционными методами для контроля качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения могут применяться методы биологического тестирования, основанные на оценке степени опасности воды источников водоснабжения и питьевой воды по реакции специально подготовленных живых организмов - тест-объектов.

Особенность информации, получаемой с помощью методов биотестирования, состоит в интегральном характере восприятия и отражения всех токсических воздействий, обусловленных совокупностью содержащихся в воде токсикантов и комплексных факторов их совместного присутствия.

При этом применение различных методов биотестирования должно быть ограничено определенными условиями в отношении целей контроля, места отбора проб воды, степени оперативности и т.п., в зависимости от специфических характеристик каждого конкретного метода. Возможно комплексное использование различных биотестов, взаимно дополняющих друг друга по чувствительности к различным группам токсикантов.

Во всех случаях использование методов биотестирования не может заменить аналитический физико-химический контроль, установленный действующими нормативными документами, однако биотесты могут существенно дополнить его результаты оценкой комплексного воздействия содержащихся в воде токсикантов, повысить оперативность обнаружения опасных уровней загрязнения источников питьевого водоснабжения для принятия экстренных мер по вводу резервных мощностей очистки или предупреждения потребителей, а также в ряде случае позволить увеличить периодичность отбора проб для физико-химического контроля и соответственно снизить затраты на контроль при подтверждаемом биотестами сохранении стабильных показателей уровня безопасности исходной воды в источнике водоснабжения.

Настоящий документ устанавливает общие методические рекомендации по применению различных методов биотестирования в централизованных системах хозяйственно-питьевого водоснабжения для решения конкретных задач по контролю качества воды в источниках водоснабжения и очищенной воды, подаваемой потребителям в сочетании с традиционными методами физико-химического контроля.

Методические рекомендации предназначены для использования предприятиями водоснабжения и водоотведения в целях совершенствования систем контроля качества воды, повышения его надежности и оперативности, а также могут быть использованы органами Госкомсанэпиднадзора России при выполнении надзорных функций за качеством воды источников водоснабжения и качеством питьевой воды для повышения достоверности оценки безопасности (безвредности) контролируемой воды в отношении комплексного воздействия находящихся в ней токсикантов.

ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВОДЫ В СИСТЕМАХ ХОЗЯЙСТВЕННО-ПИТЬЕВОГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ

Основными характеристиками методов биотестирования, определяющими цели и условия их возможного использования в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения, являются:

- вид тест-объекта;

- контролируемый параметр тест-объекта (тест-реакция);

- процедуры измерения тест-реакции;

- оценочные нормативы для определения степени опасности контролируемой среды (воды) для человека по замеренным параметрам тест-реакции.

В качестве тест-объектов в современных методах биотестирования для контроля безопасности (безвредности) воды могут быть использованы рыбы, ракообразные (дафнии и др.), инфузории, зародышевые организмы, водоросли, ферменты, бактерии и др.

Основные требования к тест-объектам состоят в их доступности, простоте и удобстве культивирования или хранения для использования, достаточной чувствительности к содержащимся в воде токсикантам, опасным для человека.

Тест-реакция тест-объекта при воздействии токсикантов или других неблагоприятных факторов окружающей среды может выражаться в гибели тест-объектов (выживаемости), снижении интенсивности размножения, снижении подвижности или других поведенческих характеристик, типичных для данного тест-объекта, а также в подавлении некоторых биохимических процессов, протекающих в клетках и ферментных системах.

Основные требования к тест-реакциям при выборе методов биотестирования для практического использования состоят в наличии ясно выраженной зависимости фиксируемых отклонений от нормы от концентраций токсикантов в воде, а также в возможности наблюдения и регистрации количественных значений тест-реакций с необходимой точностью и достоверностью при использовании доступных средств контроля.

Основные требования к процедурам измерения тест-реакций при использовании методов биотестирования для контроля качества воды в системах водоснабжения состоят в возможности получения требуемого "отклика" на появление в воде опасных токсикантов в максимально сжатые сроки. Это, как правило, требует использования специальных контролирующих устройств с элементами автоматизации, обеспечивающими преобразование регистрируемых тест-реакций в нормируемые величины характеристик токсичности воды.

Методы биотестирования, в которых процедуры измерения тест-реакции рассчитаны на длительный период наблюдения, могут найти ограниченное применение на стадии обследования и выбора источника водоснабжения для хозяйственно-питьевых целей или при наблюдении за источниками водоснабжения с заведомо стабильным качеством воды.

Оценочные нормативы при использовании методов биотестирования должны позволять на основе полученных результатов замеров сделать заключение о степени опасности воды и о принятии при превышении допустимых норм опасности (токсичности) воды необходимых мер по предотвращению возможной угрозы здоровью населения, потребляющего питьевую воду из данной системы водоснабжения.

В настоящее время в действующих нормативных документах отсутствуют утвержденные нормированные величины предельно-допустимых комплексных токсических воздействий, измеряемых с помощью методов биотестирования.

В связи с этим для каждого конкретного метода биотестирования в результате специальных исследований устанавливают корреляционные связи фиксируемых значений тест-реакций с возможным токсическим воздействием на теплокровных животных или с концентрациями конкретных токсикантов и на этом основании вводят определенные оценочные значения степени токсичности (опасности) контролируемой воды в зависимости от фиксируемых результатов измерений при биотестировании.

При этом следует иметь в виду, что эти оценочные значения не являются критериями опасности или безопасности воды при использовании ее человеком для питьевых целей в течение длительного времени; они могут только указывать на вероятность наличия или отсутствия в воде опасных концентраций токсических загрязнений, что должно подтверждаться результатами соответствующего химического контроля, на основании которого с учетом действующих ПДК делается заключение о соответствии питьевой воды установленным требованиям и ее пригодности для использования людьми.

Вместе с тем, в сравнительном плане при оценке, например, различных технологий очистки воды, обеспечивающих ее соответствие нормативным требованиям по отдельным видам токсикантов, предпочтение должно отдаваться тем методам, которые обеспечивают более высокий уровень безопасности, определяемый методами биотестирования.

В таблице 1 приведены основные характеристики методов биотестирования, рекомендуемых для использования в целях контроля качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения. Описание методов приведено в справочных приложениях, нумерация которых соответствует номерам тест-объектов в таблице 1.

Таблица 1

Тест-объект	Тест-реакция	Способ измерения тест-реакции	Норматив (индекс токсичности)
1. Клеточный тест-объект (гранулиро- ванная сперма быка)	Изменение показателей подвижности тест-объекта	Подсчет числа флуктуаций интенсивности рассеянного излучения, вызванного прохождением тест-объекта через оптический зонд, с использованием автоматической контрольной системы	Допустимые значения индекса токсичности (отношение определяемых значений, характеризующих подвижность тест-объекта в опытном и контрольном растворах): %
2. Инфузории парамеции	Реакция хемотаксиса - число инфузорий, направленно перемещаю- щихся в зоне анализа	Измерение приборами серии "Биотестер" (например, "Биотестер-2"), обеспечивающими регистрацию тест-реакций с выдачей данных в условных единицах токсичности.	Допустимые значения индекса токсичности (допустимая степень загрязнения): ; высокая степень загрязнения:
3. Инфузории тетрахимена- периформис	Изменение выживаемости и интенсивности размножения	Визуальная оценка (подсчет) под микроскопом количества тест-объектов через определенные промежутки времени (15 мин, 1 час, 6 час, 24 часа, 48 часов).	Острое токсическое действие - гибель 100% инфузорий в течение 6 часов. Хроническое токсическое действие при коэффициенте токсичности (снижение числа тест-объектов по сравнению с контролем за 48 часов.) и
4. Штамм бактерий Е-колли	Изменение уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов (подавление актив. фермента)	Определение времени обесцвечивания метиленового-синего, как косвенного показателя активности фермента дегидрогеназы.	Признак отсутствия токсичности - отклонение времени обесцвечивания от контрольной пробы меньше, чем на 15%.
5. Ракообраз- ные (дафнии, цеиодафнии)	Изменение показателей выживаемости и плодовитости	Визуальная оценка (подсчёт) количества тест-объектов через определенные промежутки времени в сопоставлении с контрольными пробами.	Острое токсическое действие - гибель более 50% ракообразных за 96 часов. Хроническое токсическое действие - достоверное снижение по сравнению с контролем тест-объектов в течение 20 суток.
6. Водоросли (сценедесмус, хлорелла)	Снижение интенсивности размножения (прироста клеток водорослей)	Визуальная оценка (подсчет) прироста числа клеток в сопоставлении с контрольным опытом.	Показатель токсического действия - достоверное снижение коэффициента прироста числа клеток по сравнению с контролем через 96 часов (острое токсическое действие) и через 14 суток (хроническое токсическое действие)
7.Рыбы (гуппи, данио)	Снижение выживаемости	Визуальная оценка (подсчет) среднего количества тест-объектов, выживших в тестируемой воде в сопоставлении с контрольным опытом	Острое токсическое действие - гибель 50% и более рыб за 96 часов. Хроническое токсическое действие - достоверное снижение выживаемости рыб за 30 суток по сравнению с контрольным опытом

Наряду с перечисленными в таблице 1, практическое применение для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения находят специальные методы, в частности, для определения суммарной мутагенной активности с использованием биологических тест-систем после проведения соответствующей подготовки. При анализах питьевой воды такая подготовка включает операции экстракции, концентрирования и стерилизации. Для оценки мутагенного потенциала полученных экстрактов наиболее часто применяется тест Эймса (сальмонелла/микросомы) и тесты на индукцию цитогенетических нарушений (хромосомные аберрации, микроядра, сестринские хроматидные обмены). Описание указанных процедур содержится в "Методических указаниях по экспериментальной оценке суммарной мутагенной активности загрязнений воздуха и воды" (Минздрав СССР, М.,1990). Сложность реализации указанных методов обуславливает возможность их применения в специальных лабораториях НИИ, имеющих необходимое оборудование и квалифицированный персонал.

В частности, указанные исследования систематически проводятся в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина РАМН.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВОДЫ В ЦЕНТРАЛИЗОВАННЫХ СИСТЕМАХ ХОЗЯЙСТВЕННО-ПИТЬЕВОГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ

Контроль качества воды в централизованных системах хозяйственно-питьевого водоснабжения включает отбор и анализ проб воды в следующих основных элементах технологической схемы:

- в источнике водоснабжения перед водозабором;

- на промежуточных стадиях процесса водоподготовки (технологический контроль);

- в емкости чистой воды и (или) из трубопроводов перед подачей в водопроводную распределительную сеть;

- в водопроводной сети из распределительных колонок или кранов

Кроме того, в крупных системах водоснабжения силами предприятия водоснабжения проводится контроль поверхностных источников водоснабжения путем отбора проб в различных створах как правило, в пределах зоны санитарной охраны.

С учетом специфики методов биотестирования, связанной с чувствительностью большинства тест-объектов к дезинфектантам, используемым в процессе водоподготовки, а также особенностей отдельных методов биотестирования в отношении сроков получения результатов (возможности реализации экспресс-контроля) и степени универсальности по выявлению различных видов токсикантов в табл.2 изложены рекомендации по предпочтительному использованию различных видов биотестов для контроля качества воды в различных объектах и различных контрольных точках систем водоснабжения.


Таблица 2

Объект контроля	Контрольные точки
Вода в источнике водоснабжения	Контрольные створы в пределах зон санитарной охраны
________________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют СанПиН 2.1.5.980-00 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
		2. Непрерывный оперативный "Алярмконтроль" для своевременного обнаружения внезапного появления в источнике водоснабжения опасных концентраций токсикантов, наличие которых требует принятия специальных мер по дополнительному химическому контролю, очистке воды и (или) предупреждению населения.
		3. Периодический контроль для определения степени опасности воды по совокупному действию находящихся в ней токсикантов.
	зона водозабора	4. Непрерывный оперативный автоматизированный "Алярм-контроль"
		5. Периодический контроль для подтверждения соответствия исходной воды общим требованиям безопасности
Питьевая вода	ёмкости чистой воды и контрольные точки перед входом в систему распределения	6. Периодический контроль после дехлорирования по общему токсическому действию токсикантов, которые могут образовываться в процессе очистки и обеззараживания воды (продукты дезинфекции - галогенорганические соединения и др.)
	водоотборные устройства в сети водоснабжения	7. Периодический контроль проб воды для подтверждения отсутствия токсичного воздействия питьевой воды после прохождения по трубопроводам водопроводной системы.
Материалы, используемые в оборудовании, изделиях и процессах		8. Подтверждение отсутствия токсического эффекта в результате взаимодействия материалов с водой для выдачи разрешений на применение материалов (веществ) в сфере питьевого водоснабжения

В дополнение к рекомендациям, изложенным в табл.2, следует учитывать некоторые изложенные ниже особенности методов биотестирования, связанные с их чувствительностью к отдельным группам токсикантов и возможностями сопоставления фиксируемых результатов тест-реакций с данными стандартизованных методов химико-аналитического контроля.

Для клеточного тест-объекта (гранулированная сперма быка) экспериментально установлены корреляционные зависимости измеряемой тест-реакции от уровня токсикометрических параметров ( - половинная смертельная доза для крыс) и концентраций широкого круга органических токсикантов (хлорированные углеводороды, фенолы, акриламид, формальдегид и др.), которые, в частности, могут попадать в воду при контактах с полимерными материалами и изделиями. Определены предельные значения индекса токсичности, при которых отсутствует реакция лабораторных животных на совокупность различных токсикантов, находящихся в воде в определенных концентрациях. На этой основе данный метод одобрен Минздравом России для оценки полимерных материалов, используемых в медицинской технике. Установлена также чувствительность тест-объекта к тяжелым металлам (ртуть, свинец, кадмий).

Для методов биотестирования с использованием инфузорий установлены данные, характеризующие содержание в воде и концентрации ряда органических и неорганических компонентов, при которых фиксируется тест-реакция, отражающая острое токсическое действие указанных компонентов. На этой основе данный метод может быть рекомендован, в частности, для контроля за качеством воды в водных объектах (источниках водоснабжения), в которых могут содержаться токсичные соединения металлов (ртуть, хром, кадмий, никель, медь, цинк) и органические соединения (хлороформ, бензол, акриламид, винилацетат, метилметакрилат и др.).

При применении в качестве тест-объекта ферментных систем (оценка угнетения дегидрогеназы) выявлена достаточно высокая чувствительность тест-реакций на присутствие в воде повышенных концентраций ионов тяжелых металлов (ртуть, свинец, медь, кадмий), а также ряда органических соединений (фенолы, резорцин, гидрохинон и др.). Специфической особенностью при использовании ферментных тест-систем вместо живых организмов является отсутствие достаточной чувствительности к дыхательным ядам (цианиды), канцерогенам типа бензапирена, а также к некоторым анионам (нитриты, нитраты).

Использование ракообразных, водорослей и рыб в системах биотестирования для определения острого и хронического токсического действия контролируемой воды с соответствующей продолжительностью экспериментов характеризует общий уровень загрязнения воды токсичными компонентами и наличие неблагоприятных факторов, влияющих на жизненные функции организмов. В отношении чувствительности к отдельным токсикантам эти методы относительно менее специфичны по сравнению с применением, например, инфузорий, однако фиксируемые тест-реакции могут проявляться при опасных концентрациях в воде тяжелых металлов (ртуть, хром и др.), фенолов и их производных, отдельных высокотоксичных пестицидов и т.п.

При сопоставлении чувствительности методов биотестирования с методами аналитического химического определения отдельных химических веществ в пробах контролируемой воды отмечается, как правило, невозможность фиксации тест-реакций при низких концентрациях загрязнений воды на уровне ПДК, которые количественно определяются химическими методами.

Реально фиксируемые с необходимой достоверностью тест-реакции при наличии в воде индивидуальных токсикантов для типовых методов биотестирования в режимах экспресс-контроля наблюдаются при концентрациях, существенно превышающих ПДК.

Так, при использовании биотеста с инфузориями острое токсическое действие проявляется при концентрациях, составляющих для никеля - 5 ПДК, хрома и кадмия - 10-20 ПДК, хлороформа - 50 ПДК, бензола - 100 ПДК, фенола - 500 ПДК. Исключение составляет ртуть, для которой острый токсический эффект фиксируется при содержании 1-2 ПДК.

Однако все это относится только к случаям загрязнения воды индивидуальными токсикантами, а основное преимущество методов биотестирования проявляется в фиксации совокупного действия присутствующих в воде токсикантов, когда может иметь место суммирование воздействующих факторов, существенно снижающих уровень обнаружения отдельных токсикантов. При этом возможность экспресс-контроля при применении методов биотестирования с соответствующим приборным оснащением позволяет своевременно выявить возникновение чрезвычайных ситуаций, когда внезапно возникающие высокие уровни загрязнения воды опасными токсикантами могут нанести ущерб здоровью населения в короткие сроки при потреблении небольших количеств воды.

Сводные данные об организациях-разработчиках методов биотестирования, указанных в таблицах 1 и 2, и основных публикациях по этим вопросам, приведены в табл.3.


Таблица 3

NN методик по табл.1 и тест-объекты	Организации-разработчики и консультанты	Литературные источники
1 Клеточный тест-объект (гранулированная сперма быка)	Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники (ВНИИИИМТ), г.Москва; АО "БМК-ИНВЕСТ" г.Москва	Количественный экспресс-метод оценки токсичности питьевой воды, природных вод и промышленных стоков с применением клеточного тест-объекта. А.П.Еськов, Р.И.Каюмов, Ю.С.Ротенберг Биотестирование с помощью суспензии сперматозоидов "Гигиена труда и профессиональные заболевания" N 8, 1989 г.
2 Инфузории парамеции	АО "Квант" г.Санкт-Петербург	Методика определения токсичности проб воды экспресс-методом на приборе "Биотестер" НИИ Гигиены и профпаталогии МЗ СССР, Л-д 1991 А.В.Пожаров, Ю.А.Рахманин, С.А.Шелемотов. Прикладные аспекты аппаратурного биотестирования воды. "Гигиена и санитария" 1994 г.
3 Инфузории тетрахимена периформис	НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина (НИИЭЧиГОС), г.Москва	Методы биотестирования вод, Черноголовка, 1988
4 Штам бактерий Е-колли (фермент дегидрогеназа)	Московский научно-исследовательский институт гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана (МНИИГ), г.Москва	Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе и воде. Справочное пособие, ГИПХ, Л-д, 1972
5 Ракообразные (дафнии, цериодафнии)	ВНИИВОДГЕО, г.Москва; Гидрохимический институт г. Ростов; Институт биологии внутренних вод РАН (ИБВВ), г.Дубна; ГУАК, Минприроды России, г.Москва	Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-09* Госкомприроды СССР, М.,1991 МС ИСО 6341:1989 "Качество воды. Определение подавления подвижности дафний"
6 Водоросли (сценедесмус, хлорелла)	МГУ, г.Москва	Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90 Госкомприроды СССР, М.,1991 МС ИСО 6341:1989 "Качество воды. Тест замедления роста пресноводных водорослей"
7 Рыбы (гуппи, данио)	Научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства (ВНИРО), г.Ростов; МГУ, г.Москва	Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-09 Госкомприроды СССР, М.,1991 М.Н.Ильин. Аквариумное рыбоводство, М., изд.МГУ, 1997
8 Сальмонелла (биологические тест-системы для определения мутагенной активности)	НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина, г.Москва	В.В.Соколовский, В.С.Жуков, Ю.А.Рахманин, И.Н.Рыжова. Методические указания по экспериментальной оценке суммарной мутагенной активности загрязнений воздуха и воды, Минздрав СССР, М.,1990; А.М.Фонштейн, С.К.Абилев и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем; Методические указания, М., 1985

ПРИЛОЖЕНИЕ 1: БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНОГО ТЕСТ-ОБЪЕКТА (гранулированная сперма быка)

1. Принцип метода

Принцип метода основан на анализе зависимости показателя подвижности суспензии сперматозоидов от времени и определении подавления их подвижности (сокращения среднего времени подвижности) под воздействием содержащихся в контролируемой воде токсикантов

Сперматозоиды могут существовать вне организма в средах простого состава до нескольких часов без изменений своих функциональных свойств.

Основное назначение половых клеток как носителей наследственной информации - оплодотворение яйцеклетки. Выполнение этой функции определяется их возможностью продвижения к месту оплодотворения, вследствие чего именно подвижность является основным показателем физиологического, биохимического и морфологического статуса сперматозоидов, который оказывается весьма чувствительным к воздействию широкого круга токсикантов.

Реализация метода осуществляется с применением автоматической аналитической системы (комплекса приборов), обеспечивающей сравнительную оценку показателя подвижности суспензии сперматозоидов в опытных (испытуемых) пробах воды и в контрольных средах, определение процедур расчетов и выдачу результатов в виде соответствующих индексов токсичности оцениваемых проб воды.

Оцениваемый системой показатель подвижности () определяется как функция концентрации подвижных клеток и среднего модуля их скорости

Где - коэффициент, связанный с конструкцией измерительной системы.

Оценка показателя подвижности осуществляется путем автоматического подсчета числа флуктуаций интенсивности рассеянного излучения, вызванного прохождением клеток через оптический зонд.

2. Тест-объект

В качестве тест-объекта используются сперматозоиды быка. Сперму получают на станциях искусственного осеменения в виде гранул, замороженных в жидком азоте. В замороженном виде в сосуде Дьюара с жидким азотом сперму можно хранить неограниченно долго.

Долив азота (4-5 литров) производят каждые 4-5 дней.

Коэффициент вариации концентрации сперматозоидов в гранулах спермы не превышает 10%, что обеспечивает достаточную стабильность и воспроизводимость в экспериментах по оценке их подвижности в контролируемых водных средах.

3. Аналитическая система

Аналитическая система включает комплекс приборов, в состав которого входит анализатор токсичности, блок подготовки образцов и компьютер с принтером, обеспечивающие автоматическое проведение оценки контролируемой тест-реакции, обработку результатов сравнительной оценки подвижности и выдачу итоговых данных в виде соответствующих распечаток.

Технические характеристики системы:

- длина волны лазерного излучения - 0,63 мкм;

- мощность лазерного излучения - не менее 1 мВт,

- время одного анализа - от 10 до 300 с с шагом 10 с;

- время перемещения кюветы (капилляра) с образцом - не более 2 с;

- время обратного хода каретки - не более 15 с;

- температура проб и рабочих образцов - 35-45 °С;

- допустимые пределы отклонения от установленной температуры - ±1,5 °С;

- объем кюветы (капилляра) с контролируемым образцом - 25 мкл;

- компьютер типа IBM PC AT (и последующие модели).

Блок-схема системы приведена на рис.1

Блок-схема комплекса

Рис.1. Блок-схема системы

1 - капилляр, 2 - каретка, 3 - привод, 4 - блок термостатирования капилляров, 5 - лазер, 6 - светоделительная пластина, 7 - микрообъектив, 8 - светоделительная пластина, 9 - экран, 10 - маска, 11 - фотодиод, 12 - усилитель, 13 - контроллер, 14 - компьютер, 15 - принтер, 16 - блок подготовки проб и рабочих образцов

Конструктивное исполнение системы обеспечивает возможность визуального наблюдения за клеточными тест-объектами в суспензии.

4. Вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

Вспомогательное оборудование, материалы и реактивы включают:

- комплект кювет (капилляров) для помещения контролируемых образцов в аналитическую систему;

- пробирки с притертыми пробками по ГОСТ 1770-74 объемом 3-5 мл - 40шт.;

- пипеточные дозаторы объемом 0,2 мл и 0,5 мл;

- колбы мерные с притертыми пробками объемом 1000 мл - 2шт.;

- колбы конические с притертыми пробками объемом 50 мл и 100 мл - по 10 шт., объемом 500 мл и 1000 мл - по 2 шт.;

- весы торсионные типа ВТ-500;

- пинцет анатомический;

- сосуд Дьюара емкостью 26,5 л марки СДП-25 - 2 шт.;

- сосуд Дьюара емкостью 5 л марки СДС-5 - 1 шт.;

- шкаф сушильный;

- холодильник бытовой;

- сперма быка в гранулах, замороженная при температуре жидкого азота;

- азот жидкий;

- цитрат натрия кристаллический, х.ч.;

- глюкоза кристаллическая;

- спирт этиловый;

- вода дистиллированная;

- бидистиллят.

5. Условия и процедура биотестирования

5.1. Температура рабочих сред при проведении биотестирования должна поддерживаться в пределах 40±1,5 °С. Это достигается автоматическим термостатирующим устройством.

5.2. Проведение испытаний

5.2.1. Включают аналитическую систему нажатием тумблера "Сеть" за 30 мин до начала испытаний. С помощью компьютера задают условия проведения испытаний: температуру, время одного анализа, количество кювет (капилляров) с образцами. Информация о достижении необходимой температуры и готовности системы к работе выдается на дисплей.

5.2.2. Готовят опытные и контрольные растворы. В качестве контрольного раствора применяют глюкозо-цитратную среду состава: глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, вода дистиллированная - 100 мл. Контрольная среда одновременно является разбавителем для оттаивания замороженной спермы. Изотонию опытного (испытываемого) раствора (проб воды) достигают путем добавления сухих реактивов: 4 г глюкозы и 1 г цитрата натрия на 100 мл воды. Вместо дистиллированной воды может быть использована "фоновая" проба воды из источника с известными показателями химического состава, отвечающими требованиям безопасности.

5.2.3. Дозируют по 1 мл контрольного и испытываемого раствора в пробирки и помещают в водный термостат для термостатирования при температуре 40±1,5 °С.

5.2.4. Для оттаивания замороженной спермы отмеривают в пробирки по 0,5 мл разбавителя (по п.5.2.2) и термостатируют их при температуре 40±1,5 °С. Охлажденным анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор. Каждую гранулу размораживают в отдельной пробирке. Сразу после размораживания спермы содержимое пробирок сливают в одну пробирку и тщательно перемешивают. Смесь термостатируют при 40±1,5 °С.

5.2.5. Рабочие образцы для биотестирования в аналитической системе готовят путем внесения в каждую пробирку с контрольным и испытываемым растворами по 0,2 мл суспензии сперматозоидов (по п.5.2.4).

5.2.6. Для проведения анализов рабочие образцы из пробирок с контрольным и испытываемым растворами (по п.5.2.5) переносят в капилляры, выполняющие функции кювет, и герметизируют их путем поочередного окунания концов капилляров в ванну с парафином.

Капилляры с рабочими образцами помещают на каретку и устанавливают в привод аналитической системы.

С помощью компьютера проводят идентификацию капилляров и запускают процесс накопления экспериментальных данных. Процесс продолжают до достижения нулевых значений показателя подвижности во всех капиллярах, после чего проводят математическую обработку результатов по алгоритмам, реализуемым программой компьютера согласно изложенным ниже методическим положениям.

6. Обработка и оценка результатов

6.1. В результате эксперимента в системе для каждого образца биотестируемых растворов (испытываемых и контрольных проб воды) регистрируется зависимость:

где - показатель подвижности (по п.1),

- время

7.6.2. Для каждой из указанных зависимостей вычисляется средневзвешенное значение времени подвижности ,

Где - -ое значение показателя подвижности,

- текущий номер оценки показателя подвижности.

6.3. Для контрольной и опытной выборок образцов вычисляют среднее арифметическое значение и среднее квадратическое отклонение, по которым в свою очередь рассчитывают для каждой выборки коэффициент вариации , по формуле:

Где - среднее квадратическое отклонение,

- среднее арифметическое значение

В случае получения коэффициента вариации более 15% хотя бы для одной из выборок, повторяют эксперимент. Если значение коэффициента вариации для каждой из выборок меньше или равно 15%, то результаты контроля считают достоверными.

6.4. Вычисление индекса токсичности проводится по формуле:

Где и - средние арифметические значения средневзвешенного времени подвижности, соответственно, для опытной и контрольной выборок образцов.

6.5. Критерием отсутствия токсического воздействия является нахождение величин в интервале значений от 70 до 130%.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2: БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ PARAMECIUM

1. Принцип метода

Методика биотестового анализа водных проб основана на способности Paramecium caudatum - инфузории туфельки (далее - инфузории) избегать неблагоприятных и опасных для жизнедеятельности зон и активно перемещаться по градиентам концентраций химических веществ в зоны благоприятные (реакция хемотаксиса). Методика позволяет оперативно определять острую токсичность водных проб.

2. Характеристика тест-объекта, выращивание и подготовка культуры к анализу

2.1. В качестве тест-объекта используется Paramecium caudatum - инфузория туфелька. Относится к подцарству простейших (одноклеточных животных) - Protozoa, типу - Ciliophora. Инфузория широко распространена в пресных водоемах. Форма клетки эллипсоидная, размеры - 200х40 мкм. Основную пищу инфузории составляют бактерии, дрожжи и т.п. Размножение инфузории происходит путем поперечного деления клетки. В зависимости от условий выращивания время генерации может составлять от нескольких часов до нескольких суток.

По сравнению с другими группами простейших инфузории имеют наиболее сложное строение и отличаются разнообразием функций. Инфузория находится в непрерывном движении. Скорость ее при комнатной температуре - 2,0-2,5 мм/с. Траектория движения сложная: она движется вперед, вращаясь вдоль продольной оси тела, с помощью ресничек, количество которых достигает 10-15 тысяч. Изменение внешних условий (температура, химический состав среды, электромагнитные колебания и другие факторы) воспринимаются клеткой, и первая ответная реакция - изменение характера движения: уменьшение или увеличение скорости, частоты остановок и разворотов, разнообразные таксисы, например, гео-, магнито-, аэро-, хемотаксис.

2.2. Исходный материал для выращивания культуры инфузории передается при поставке прибора "БИОТЕСТЕР-2". Культуру можно также получить из коллекций культуры простейших, имеющихся в различных научных организациях (например, в БиНИИ СПб ГУ: 198904; Старый Петергоф, Ораниенбаумское шоссе, 2). Можно выделить свою культуру из местных водоемов или приобрести у аквариумистов, но необходимо при этом учитывать, что видовую принадлежность может определить специалист-протозоолог, т.к. существуют другие представители рода Paramecium caudatum.

2.3. Выращивание культуры

2.3.1. В данной методике может быть использована культура инфузории, выращенная по различным методикам, которые обеспечивают получение тест-объекта, во-первых, в достаточном для анализов количестве, во-вторых, чувствительного к модельному токсиканту в пределах концентраций, установленных в п.2.3.

Выращивание культуры проводят в любых удобных сосудах, например, в стеклянных колбах, стаканах, чашках Петри и других. В качестве корма используют бактерии, дрожжи и их смесь, выращенные стерильно на твердых средах. При отсутствии условий для выращивания стерильного корма, можно использовать воздушносухие пекарские дрожжи.

К общим положениям по выращиванию культуры относится обязательное требование идентичности среды выращивания и среды, которая будет использована для процедур отмывания культуры от продуктов метаболизма, получения рабочей взвеси, разведения водных проб и прочих процедур с культурой.

Метод культивирования инфузории приведен ниже в качестве примера.

2.3.2. Метод культивирования инфузории

В широкогорлую коническую колбу на 200 мл вносят суспензию инфузорий в среде Лозина-Лозинского в количестве 100 мл с плотностью 1000±200 клеток/мл. В качестве корма добавляют воздушносухие дрожжи из расчета 1 мг на 1 мл среды. Выращивание ведут при температуре 18-26 °С.

Для биотестового анализа используют культуру в начале стационарной фазы роста. Для контроля за развитием популяции отбирают ежесуточно пробу, в которой определяют количество клеток по п.2.3.4.1. Отсутствие прироста клеток в популяции свидетельствует о наступлении стационарной фазы роста, ежесуточный контроль позволяет определить ее начало. Обычно при заданных в начале данного раздела условиях стационарная фаза роста наступает на 2-3 сутки, при этом плотность культуры будет составлять 4000±1000 клеток/мл.

2.3.3. Поддержание и хранение культуры

При перерывах в проведении биотестовых анализов культуру достаточно поддерживать только как посевной материал. Один из способов поддержания - на зернах риса. В чашку Петри помещают 2-3 сырых зернышка риса, добавляют среду около 30-40 мл и помещают клетки инфузории туфельки в количестве 50-100 клеток/мл. Раз в 2 недели меняют среду и зерна риса.

Удобно содержать резервную культуру в пробирках. Один раз за 7-10 суток концентрат клеток из верхней части пробирки (без перемешивания) переливают в другую пробирку, добавляют среду Л-Л до прежнего объема и по 0,5 мг дрожжей на 1 мл жидкости.

Другой способ консервации культуры - хранение в холодильнике при низких положительных температурах. Скорость деления при этом может составлять одно деление в 10-20 суток. Культуру отмывают от продуктов метаболизма и старого корма, доводят концентрацию взвеси до 200±100 клеток/мл, добавляют сухие дрожжи 0,2 мг/мл и помещают в холодильник. Так культура сохраняется до месяца. При использовании культуры, сохранявшейся в холодильнике, необходимо дождаться выравнивания ее температуры с температурой остальных растворов и только после этого производить необходимые процедуры.

Особое внимание следует обратить на то, что инфузория не выдерживает резких перепадов температуры (!).

2.3.4. Определение концентрации взвеси инфузории

Концентрацию клеток необходимо определять в процессе выращивания культуры, при подготовке рабочей взвеси клеток и для определения величины тест-реакции. Определение концентрации клеток инфузорий без затруднений выполняется с помощью отградуированного прибора серии "Биотестер".

2.3.4.1. В общем случае концентрацию клеток инфузории определяют подсчетом клеток под микроскопом по общепринятым в микробиологической практике методикам: с помощью измерительных сеток, счетных камер и т.п. Подсчитанное количество клеток пересчитывают на единицу объема среды и выражают как концентрацию (клеток/мл). Ниже приводится пример способа подсчета клеток инфузорий. Исходную взвесь инфузорий взболтать, отобрать с помощью пипетки 0,5 мл взвеси. К этому объему добавить 9,5 мл 1% раствора NaCI. Таким путем достигается обездвиживание инфузорий. Не дожидаясь полного обездвиживания инфузорий (примерно через 2-5 мин) из разбавленной взвеси отбирают 0,5 мл и распределяют этот объем в виде 6-10 крупных капель на сухом стекле (например, в чашке Петри). С помощью микроскопа (лупы) подсчитывают инфузории во всех каплях. Полученный результат пересчитывают на 1 мл исходной взвеси.

Например: 0,5 мл взвеси обездвиженных инфузорий распределены в 6 каплях, в которых было сосчитано 29, 38, 32, 31, 28, 35 клеток - всего 193. В 1 мл разбавленной взвеси содержится 386 клеток, а в 1 мл исходной взвеси, следовательно, будет содержаться 3860 клеток инфузорий.

2.3.4.2. Специализированным средством для определения количества подвижных клеток инфузории является прибор серии "Биотестер". Определение концентрации подвижных клеток проводят по предварительно построенной градировочной кривой.

Для построения градировочной кривой берут взвесь клеток инфузории в среде Л-Л по п.2.3.2. Из взвеси готовят ряд разведений, каждое из которых по концентрации меньше предыдущего в 2 раза, объем взвеси каждого разведения не менее 5 мл. Последнее разведение может содержать 5-10 кпеток/мл. Исходную концентрацию клеток определяют подсчетом числа клеток под микроскопом (см.п.2.3.4.1). Концентрации клеток в серии разведений определяют соответствующим расчетом. При этом последовательно определяют концентрацию подвижных клеток инфузорий, находящихся в исходной рабочей взвеси и во всех разведениях, снимая показания на приборе. Для этого заполняют кювету контролируемой взвесью клеток до верха (инфузории не обездвиживать!), помещают в кюветный модуль прибора и снимают ряд показаний.

Процедуру подсчета клеток в исходной взвеси, приготовление разведений, измерение на приборе исходной взвеси и разведений повторяют не менее 3 раз и результаты усредняют. По полученным данным строят градировочную кривую как зависимость показаний прибора от логарифма концентрации клеток. Построенная кривая может быть использована продолжительное время с одним и тем же измерительным прибором.

2.4. Подготовка инфузорий к анализу

2.4.1. Выращенную по п.2.3 культуру инфузории отмывают от продуктов метаболизма и корма, доводят концентрацию до рабочего значения, проводят проверку готовности культуры к анализу по ее чувствительности к модельному токсиканту и по ее способности выходить в чистую пробу.

2.4.2. Отмывание культуры

При отмывании используют нормальную физиологическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости. Использование сосудов с узким длинным горлом позволяет сконцентрировать инфузории в верхней зоне и слить в другой сосуд с минимальным количеством загрязненной культуральной среды. Концентрат разбавляют чистой средой Л-Л, опять собирают клетки в верхней зоне и сливают. В результате отмывания инфузорий степень разбавления культуральной жидкости чистой средой должна быть не менее 1:200.

Пример. Культура выращена на среде Л-Л. Отмывочная среда - Л-Л. К 50 мл культуры добавляют 50 мл среды Л-Л, тщательно переливают в мерную колбу на 100 мл, обязательно заполняя горлышко. Через 5-15 минут инфузории собираются в верхней зоне. Сливают верхнюю часть жидкости из колбы. Получают взвесь клеток с разбавлением культуральной жидкости в два раза и объемом, например, 20 мл. Процедуру по отмыванию повторяют еще 2 раза, добавляя к 20 мл взвеси 80 мл среды Л-Л и получают взвесь клеток, например, в объеме 10 мл с разбавлением исходной взвеси инфузорий в 50 раз. Доводят объем полученной взвеси (10 мл) и получают разведение в 250 раз. Определяют концентрацию клеток в полученной взвеси по п.2.3.4 и доводят ее до значения 1000±200 кл/мл. Полученную рабочую взвесь клеток инфузорий после предварительной проверки используют в течение 1,5 часов.

2.4.3. Проверка готовности взвеси инфузорий к анализу

Проверку проводят по двум параметрам одновременно:

- по степени выхода инфузорий в контрольную чистую пробу;

- по чувствительности к модельному токсиканту.

2.4.3.1. Для проверки выхода инфузорий в контрольную пробу заполняют по п.4.1 три кюветы взвесью клеток, наслаивают среду Л-Л или заведомо нетоксичную воду (но не дистиллят). Через 30 минут измеряют концентрацию клеток в верхних зонах кювет по п.4.2. Усредняют результат по 3 кюветам и определяют готовность тест-культуры к биотестовому анализу по условию: выход должен быть не менее 70% от концентрации рабочей взвеси.

2.4.3.2. Для проверки чувствительности к модельному токсиканту в три кюветы наслаивают раствор сульфата меди с концентрацией 0,1 мг/л, приготовленный по п.3.4. Через 30 минут измеряют концентрацию в верхних зонах кювет по п.4.2 и рассчитывают индекс токсичности к раствору сульфата меди.

При культуру используют в биотестовом анализе.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, растворы.

3.1. Средства измерений:

- микроскоп бинокулярный с увеличением порядка 10-50;

- прибор серии БИОТЕСТЕР, например, БИОТЕСТЕР-2 - специализированный импульсный фотометр по ТУ 401-51-005-91* с набором фотометрических кювет;
________________
* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, не приводятся. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке . - Примечание изготовителя базы данных.

- весы лабораторные общего назначения (ГОСТ 8.520-84).

3.2. Вспомогательные устройства:

- сосуды для культивирования из химически инертного материала, например, химические стаканы, конические широкогорлые колбы, чашки Петри (ГОСТ 25336-82);

- пипетки, мерные колбы, пробирки (ГОСТ 20292-74 , 1770-74).

3.3. Материалы:

- соли марки ч.д.а. или х.ч.: натрий хлористый, калий хлористый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий углекислый кислый, медь сернокислая пятиводная;

- поливиниловый спирт ПВС - марка 11/2, высший сорт (ГОСТ 10779-78);

- дрожжи хлебопекарные воздушносухие - используются в качестве корма для инфузорий.

3.4. Растворы:

- взвесь клеток инфузорий, полученная путем выращивания тест-объекта в определенных условиях (см.п.2.3), отмытая от продуктов метаболизма и корма (см.п.2.4) и доведенная до рабочей концентрации (плотности) 1000±200 клеток/мл;

- среда для культивирования и разбавления: готовится на дистиллированной воде (среда Лозина-Лозинского, в дальнейшем Л-Л). Возможно использование водопроводной воды, которая должна быть соответствующим образом обработана (дехлорировать и отстоять в течение 5-10 суток).

Для приготовления концентрата среды Л-Л в 1 л воды растворяют следующие соли (марки ч.д.а. или х.ч.): NaCI - 1,0 г, KCI - 0,1 г, MgSO - 0,1 г, CaCIx2HO - 0,1 г, NaHCO - 0,2 г. Такой раствор можно хранить в холодильнике до 7 суток. Для работы используется среда Л-Л, полученная десятикратным разбавлением исходного концентрата. Разбавляющая среда и среда для культивирования должны быть идентичны и обеспечивать выживаемость инфузории в течение 5 суток;

- модельный токсикант на основе сульфата меди. Маточный раствор сульфата меди (10 мг/л) в дистиллированной воде хранят не более недели. Рабочие концентрации сульфата меди готовят перед самым определением. Растворы соли с концентрациями до 1 мг/л готовят в дистиллированной воде, а с концентрациями 0,1 мг/л и меньше - в среде Л-Л;

- раствор ПВС в среде Л-Л: 5% раствор используют в качестве нейтрального загустителя. Для приготовления раствора ПВС 0,5 г порошка ПВС смешивают с 9,5 мл среды Л-Л. Смесь нагревают на водяной бане до растворения порошка. Используют раствор в течение суток.

4. Метод определения

4.1. Метод определения токсичности жидких сред основан на способности тест-объектов реагировать на появление в водной среде веществ, представляющих опасность для их жизнедеятельности, и направлено перемещаться по градиенту концентраций этих веществ (хемотаксическая реакция), избегая их вредного воздействия.

Хемотаксическая реакция реализуется при условии наличия стабильного и воспроизводимого градиента концентраций химических веществ. Подобный градиент создается путем наслоения в вертикальной кювете (пробирке) на взвесь инфузорий в загустителе испытуемой водной пробы. При этом в измерительной кювете образуется стабильная граница, сохраняемая в течение всего времени биотестирования. Эта граница раздела не препятствует свободному перемещению инфузорий в предпочтительном для них направлении и при этом предотвращает перемешивание жидкостей из нижней и верхней зон.

После создания в кювете двух зон в течение 30 минут происходит перераспределение инфузорий по зонам. Важная особенность поведенческой реакции инфузорий - массовое перемещение клеток в верхние слои жидкости. В случае, если исследуемая проба не содержит токсических веществ, в кювете будет наблюдаться концентрирование клеток инфузорий в верхней зоне. Наличие в исследуемой пробе токсических веществ приводит к иному характеру перераспределения инфузорий в кювете, а именно, чем выше токсичность пробы, тем меньшая доля инфузорий перемещается в верхнюю зону (исследуемую пробу).

4.2. Критерием токсического действия является значимое различие в числе клеток инфузорий, наблюдаемых в верхней зоне кюветы в пробе, не содержащей токсических веществ (контроль), по сравнению с этим показателем, наблюдаемым в исследуемой пробе (опыт)

4.3. Количественная оценка параметра тест-реакции, характеризующего токсическое действие, производится путем расчета соотношения числа клеток инфузорий, наблюдаемых в контрольной и исследуемой пробе (согласно п.8.1), и выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности (Т).

5. Условия определения

5.1. Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборанта.

5.2. На методику распространяются общие правила техники безопасности при работе с химическими реактивами общего применения и лабораторной аппаратурой (указаны в паспорте на прибор).

5.3. Инфузории работают в интервале температур 10-30 °С при соответствии их свойств требованиям п.2.3.

6. Подготовка к выполнению определения

6.1. Отбор и хранение проб

Общие процедуры отбора проб определены в следующих документах: ИСО 5667/2. Качество воды. Отбор проб. ч.2; ГОСТ 24481-80 . Вода питьевая. Отбор проб.

6.2. Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+4 °С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов.

6.3. Необходимый для выполнения анализа (в трех повторностях) объем водной пробы составляет около 10 мл. Для однократного определения достаточно 2 мл.

6.4. При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре взвеси тест-объекта. Инфузории не переносят резких перепадов температуры (!).

6.5. При наличии в пробе крупнодисперсных включений, соизмеримых по величине с клеткой инфузории или больших по размеру, необходима фильтрация пробы.

7. Проведение анализов

7.1. Заполнение кювет

В кювету вносят 2,0 мл взвеси инфузорий в рабочей концентрации, предварительно проверенной по двум параметрам: по чувствительности к модельному токсиканту (см.п.2.4.3.2) и по выходу в разбавляющую среду (см.п.2.4.3.1). К взвеси добавляют 0,35 мл 5% раствора ПВС, все тщательно перемешивают, непременно увлажнив стенки кюветы, и наслаивают (например, пипеткой) 1,8 мл анализируемой водной пробы, не допуская перемешивания с нижним слоем. Через 30 минут (продолжительность тест-реакции) последовательно производят определение концентрации инфузорий в верхней зоне кюветы в контрольных () и опытных () пробах. Контрольные и опытные пробы готовят одновременно.

7.2. Измерение концентрации инфузорий на приборе "БИОТЕСТЕР-2"

Подготовленные по п.7.1 кюветы последовательно помещают в кюветный модуль и снимают показания прибора. В приборе "БИОТЕСТЕР-2" предусмотрено три режима работы:

- измерение и индикация результата через каждые 22 с;

- измерение и индикация среднего значения результатов 5 отсчетов (через каждые 110 с);

- измерение и индикация среднего значения результатов 10 отсчетов (через каждые 220 с).

Работа с прибором:

а) установить режим усреднения "1" (горит светодиод над кнопкой, соседние светодиоды погашены);

б) вставить кювету в кюветную нишу, закрыть крышку, нажать кнопку "ПУСК";

в) индикация гаснет, на 12 с (время автоподстройки) загорается светодиод "ОТСЧЕТ", и еще через 22 с на индикационном табло появляется первое значение концентрации в условных единицах. Выдача отсчета сопровождается световым и звуковым сигналом продолжительностью 2 с;

г) в течение 22 с значение предыдущего отсчета сохраняется, этого времени достаточно для регистрации результата.

Если концентрация токсикантов настолько велика, что инфузории практически не выходят в пробу (показания прибора в условных единицах находятся в пределах 000-008), то начинает мигать светодиод "ТРЕВОГА". Это означает, что испытуемую пробу необходимо разбавить до получения на приборе значимых величин. (Не забудьте скорректировать оценку токсичности в соответствии со степенью разбавления исходной пробы).

Последовательность операций при использовании других режимов измерений идентична вышеописанной. Обычно работают в режиме усреднения по 5 показаниям. Контрольные и испытуемые пробы делают в трех повторностях. Значения повторностей усредняют и рассчитывают индекс токсичности по п.8.1.

8.Обработка и оформление результатов

8.1.Оценку токсичности водной пробы производят по относительной разнице количества клеток в верхних зонах кювет с контрольными и анализируемыми пробами.

Индекс токсичности определяется как:

где , - средние показания прибора для контрольных и анализируемых проб соответственно.

Индекс токсичности () - величина безразмерная и может принимать значения от 0 до 1 в соответствии со степенью токсичности анализируемой пробы.

По величине индекса токсичности анализируемые водные пробы классифицируются по степени их загрязнения на 4 группы:

I. Допустимая степень загрязнения ();

II. Умеренная степень загрязнения ();

III. Высокая степень загрязнения (, а также значимые значения , полученные при 2-х, 4-х, 6-кратном разбавлении анализируемой пробы);

IV. Чрезвычайно высокая степень загрязнения (значимые значения , полученные при 8-кратном и свыше разбавлении анализируемой пробы).

8.2. Пример записи результатов измерений

Номер пробы	Пов- тор- нос- ти	Показания прибора I у.е.					Ср.знач. по 5 изме- рениям , у.е.	Ср.знач. по 3 пов- торнос- тям 4 ср.у.е.	Индекс токсичности , у.е.
Контроль среда Л-Л
Проба 1					[email protected] Если процедура оплаты на сайте платежной системы не была завершена, денежные средства с вашего счета списаны НЕ будут и подтверждения оплаты мы не получим. В этом случае вы можете повторить покупку документа с помощью кнопки справа. Произошла ошибка Платеж не был завершен из-за технической ошибки, денежные средства с вашего счета списаны не были. Попробуйте подождать несколько минут и повторить платеж еще раз.

Биотестирование-метод оценки качества среды обитания (токсичности веществ) с помощью опытов с тест объектами.в пробы природной воды помещают определенное кол-во (обычно 10) тест-объектов и по истеч. Некоторого времени сравнивают с контролем.(на примере дафний: для определения острой токсичности необходимо 4 дня,для хронической токсичности -20-24 дня.)пробу донных отложений высушивают,делают вытяжку,дальше все по схеме с дафниями

Биотестирование в оценке токсичности сточных вод

При исследовании сточных вод на токсичность не допускается отбор разовой пробы.кол-во необходимых порций выбирают на основе опыта проведения анализа(согласно методическим указаниям и ГОСТам)обычно отбирают пробы каждый час в течение суток,потом все тщательно перемешивается и для биотестирования берется необходимое количество воды.пробы,взятые для исследования токсичности нельзя консервировать.и тут все как в 1-м вопросе: две банки с исследуемой водой и контроль

Биотестирование в оценке токсичности химических веществ. Показатели токсичности (LC50, LD50 и др.)

Токсичность химических веществ определяется летальной дозой(для теплокровных тест-объектов) и летальной концентрацией(для водных). LC50(лет.конц.)-такая конц в-Ва, которая вызывает гибель 50% тест ор-мов за установленное время.в качестве тест-объектов используются и водоросли,для них невозможно определить LC50, поэтому для них используется показатель IC50 (ингибирующая концентрация-замедление прироста культуры).для определения токсичности хим в-ва его разводят в воде в соотношении 1/10,1/100,1/1000. Берут 2 пробы (банки) и контроль.по истечению указанного времени сравнивают пробы с контролем, подбирается такая конц в-ва,чтоб точно определить LC50

Тест-организмы, используемые в биотестировании. Критерии выбора тест-организмов

Тест-объект - организм,используемый при оценке токсичности веществ,донных отложений,вод и почв.это специально выращенный в лабораторных условиях организм,разной систематической принадлежности (крысы,водоросли,простейшие,рыбки) Требования к ним: генетически однородны(чистые линии),адаптированы к лабораторным условиям,в идеале,реакция не должна зависеть от сезонных и суточных циклов.набор тест объектов определяется методиками

Тест-функции

Тест-функция - критерий токсичности,используемый в биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждаюшее (негативное) действие среды. Напр.: смертность/выживаемость(обычно исп. для простейших,насекомых,ракообразных,рыб),плодовитость/кол-во потомства,время его появления,появление аномальных отклонений.для растений- скорость прорастания семян,длинна первичных корешков и т.п.

Основные критерии оценки токсичности по результатам биотестирования

Токсический эффект- изменение любых показателей жизнедеятельности под воздействием токсикантов,зависит от особенностей в-в. При гибели в пробе <10% от контроля можно говорить о том,что среда не токсична.10-50% - среда безвредна.> 50% - среда токсична

Отбор, транспортировка проб, подготовка их к биотестированию

Для получения достоверной информации о токсичных свойствах пробы, ее необходимо правильно отобрать и хранить до выполнения теста.Используя карту или схему реки, выбирают места отборов проб (станции). Для более точной оценки качества воды на каждой станции отбираются несколько проб. Проба отжимается и переносится в пластиковый контейнер.биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора.при длительной перевозки пробы возможно снижение ее температуры до +4 градусов

Особенности острых и хронических опытов по биотестированию

тест на острую токсичность выражается в гибели организмов за определенный промежуток времени (то нескольких секунд од нескольких суток).Хроническая токсичность проявляется только через несколько суток и,как правило,не ведет к быстрой гибели организма,выражается в нарушении жизненно важных функций,возникновении токсикозов

← Вернуться